2-a eletroforese começa com eletroforese na primeira dimensão e então separa as moléculas perpendicularmente da primeira para criar um eletroferograma na segunda dimensão. Em eletroforese na primeira dimensão, as moléculas são separadas linearmente de acordo com seu ponto isoelétrico. Na segunda dimensão, as moléculas são então separadas a 90 graus do primeiro electroferograma de acordo com a massa molecular. Uma vez que é improvável que duas moléculas sejam semelhantes em duas propriedades distintas, as moléculas são mais efetivamente separadas em eletroforese 2-D do que em eletroforese 1-D.
as duas dimensões em que as proteínas são separadas usando esta técnica podem ser o ponto isoelétrico, a massa do complexo proteico no estado nativo, ou a massa proteica.
a separação das proteínas pelo ponto isoelétrico é chamada focagem isoelétrica (IEF). Assim, um gradiente de pH é aplicado a um gel e um potencial elétrico é aplicado em todo o gel, tornando uma extremidade mais positiva do que a outra. Em todos os valores de pH que não o seu ponto isoelétrico, proteínas serão carregadas. Se forem carregados positivamente, serão puxados para a extremidade mais negativa do gel e se forem carregados negativamente serão puxados para a extremidade mais positiva do gel. As proteínas aplicadas na primeira dimensão movem-se ao longo do gel e acumulam-se no seu ponto isoeléctrico; isto é, o ponto em que a carga global sobre a proteína é 0 (uma carga neutra).
para a análise do funcionamento das proteínas numa célula, o conhecimento da sua cooperação é essencial. Na maioria das vezes, as proteínas agem juntas em complexos para serem totalmente funcionais. A análise desta sub-organela organização da célula requer técnicas de conservação do estado nativo dos complexos proteicos. Na eletroforese em gel de poliacrilamida nativa (página nativa), as proteínas permanecem em seu estado nativo e são separadas no campo elétrico seguindo sua massa e a massa de seus complexos, respectivamente. Para obter uma separação por tamanho e não por carga líquida, como no IEF, uma carga adicional é transferida para as proteínas pelo uso de azul brilhante Coomassie ou sulfato de dodecilo de lítio. Após a conclusão da primeira dimensão, os complexos são destruídos aplicando a página SDS de desnaturação na segunda dimensão, onde as proteínas de que os complexos são compostos são separadas por sua massa.
Antes de separar as proteínas em massa, são tratadas com sulfato de dodecilo de sódio (SDS) juntamente com outros reagentes (SDS-PAGE in 1-D). Isto denota as proteínas (isto é, desdobra-as em moléculas longas e rectas) e liga um número de moléculas SDS aproximadamente proporcional ao comprimento da proteína. Porque o comprimento de uma proteína (quando desdobrada) é aproximadamente proporcional à sua massa, isto é equivalente a dizer que ela liga um número de moléculas SDS aproximadamente proporcional à massa da proteína. Uma vez que as moléculas SDS são carregadas negativamente, o resultado disso é que todas as proteínas terão aproximadamente a mesma razão massa-carga que as outras. Além disso, as proteínas não serão migradas quando eles não têm carga (resultado da isoeléctrico foco passo), portanto, o revestimento de proteína na ficha de dados de segurança (carregadas negativamente) que permite a migração das proteínas na segunda dimensão (SDS-PAGE, ele não é compatível para utilização na primeira dimensão, como é cobrado e não-iónico ou zwitterionic detergente precisa ser usado).Na segunda dimensão, um potencial elétrico é aplicado, mas em um ângulo de 90 graus a partir do primeiro campo. As proteínas serão atraídas para o lado mais positivo do gel (porque a SDS é negativamente carregada) proporcionalmente à sua razão massa-carga. Como explicado anteriormente, esta proporção será quase a mesma para todas as proteínas. O progresso das proteínas será retardado por forças de fricção. O gel age, portanto, como um crivo molecular quando a corrente é aplicada, separando as proteínas com base no seu peso molecular com proteínas maiores sendo retidas mais elevadas no gel e proteínas menores sendo capazes de passar através do crivo e chegar a regiões mais baixas do gel.