Exacerbação do substrato de toxicidade por IPTG em Escherichia coli BL21(DE3) carregando um sintético via metabólica

Biotransformação de TCP descansando E. coli BL21(DE3) as células de transporte de variantes de um sintético degradação caminho

Variantes do sintético caminho com o tipo selvagem haloalkane dehalogenase ou 26 vezes catalytically mais eficiente mutante DhaA31 foram introduzidos em E. coli BL21(DE3) . Este hospedeiro foi seleccionado porque nem as enzimas nem os metabolitos da via TCP ocorrem naturalmente na sua rede metabólica e devido ao vasto repertório de vetores de duetos disponíveis comercialmente para esta estirpe, que permitem a co-expressão sintonizável de múltiplos genes numa única célula . Isto resultou na construção de um sistema flexível com risco limitado de conversação metabólica cruzada, no qual a expressão dos três componentes da via poderia ser manipulada ortogonalmente . Três construídos anteriormente. coli BL21 (DE3) degraders designated degWT, deg31, and deg31opt were tested (Table 1). E. coli degWT carrega uma variante do TCP caminho com base no tipo selvagem DhaA em conjunto com HheC e EchA, expressa em uma relação de 0,24:0.36:0.40, respectivamente, conforme determinado após a pré-indução com 0,2 mM de IPTG (arquivo Adicionais 1: Fig. S1). As estirpes deg31 e deg31opt carregam a via TCP com a engenharia da dehalogenase Dha31, mas a relação relativa das três enzimas em deg31 é 0.14:0.41:0.45 enquanto em deg31opt é 0.63:0.16:0.21. Os experimentos com dodecilsulfato de sódio de poliacrilamida gel electroforese (SDS-PAGE) indicaram que as três enzimas de Via juntas representavam uma proporção similar da fração proteica solúvel total produzida pelas três degraders: 52% para degWT, 54% para deg31, e 44% para deg31opt.

pré-induzido (0.Incubaram-se células de repouso de 2 mM de cada uma das estirpes recombinantes e um controlo do hospedeiro (Quadro 1) em tampão fosfato com 2 mM de TCP, tendo sido registados os períodos de biotransformação do TCP ao longo de um intervalo de 5 horas (Fig. 1). Os perfis de reação revelaram diferenças fundamentais entre as estirpes no que diz respeito às taxas iniciais de dehalogenação TCP, acumulação de intermediários e eficiência global da formação de glicerol. The theoretical concentrations of glycerol, otherwise rapidly utilized by E. coli, pode ser calculado a partir das concentrações experimentais de TCP e detectou intermediários em virtude da natureza ortogonal da via . Enquanto deg31opt beneficiou do primeiro passo mais rápido (Fig. 1d), a via mais equilibrada com a maior produção de glicerol foi deg31(Fig. 1c). Por outro lado, degWT sofria de lenta conversão TCP (Fig. 1b), exposição prolongada ao substrato tóxico e saída insuficiente da via. Como esperado, o controlo do hospedeiro (carregando os plasmídeos vazios correspondentes, Fig. 1a) não mostrou qualquer atividade para TCP no sistema de lote fechado.

os três E. os recombinantes de coli e a estirpe de controlo sem a via sintética representam um sistema modelo adequado para estudar a contribuição da carga metabólica e da toxicidade do substrato/metabolito para o custo de fitness da biotransformação TCP por catalisadores de células inteiras.

a avaliação da carga metabólica e dos efeitos da toxicidade do substrato através do revestimento de

a viabilidade celular, estimada através do revestimento, é um parâmetro fisiológico fundamental que deve reflectir a capacidade das estirpes individuais para fazer face às tensões causadas pela carga metabólica e pela exposição ao TCP . E. coli degrada pré-induzida com 0.Os controlos IPTG de 2 mM e os controlos do hospedeiro foram prateados antes e depois de 5 h de incubação em tampão fosfato com ou sem TCP de 2 mM. A percentagem de células sobreviventes foi calculada após incubação.

os dados obtidos do revestimento antes da incubação (Fig. 2a) ilustrar os efeitos separados de elementos individuais da carga metabólica global imposta às células. Vários fatores, incluindo a presença de DNA plasmídeo e os marcadores de seleção associados, a adição de IPTG, e a carga devido à expressão da via heteróloga afetaram a viabilidade das degraders em paralelo, mesmo antes da adição do substrato tóxico. O impacto mais pronunciado nesta fase deveu-se à manutenção de plasmídeos e à expressão constitutiva associada dos genes marcadores de seleção dos vetores de dueto, bem como à presença de IPTG. A presença de dois plasmídeos de cópia média a alta pCDF (20-40 cópias por célula) e pETDuet (~40 cópias por célula) reduziu a viabilidade em 50 % (P < 0,01; Fig. 2a). A “pré-indução” do controlo do hospedeiro com plasmídeos vazios reduziu a viabilidade em quase 40% em relação ao controlo não induzido (P < 0,01). A expressão das enzimas da Via na E. coli degrada ainda mais a viabilidade reduzida em cerca de 20 % (P < 0, 05). A redução adicional da viabilidade do deg31opt em comparação com o degWT e o deg31 pode ser potencialmente atribuída à diferença nos marcadores de selecção de antibióticos entre três recombinantes.

Os dados coletados após 5 h de incubação com ou sem o TCP (Fig. 2b e Ficheiro adicional 1: Fig. S2) incluiu várias observações inesperadas. Surpreendentemente, o TCP (inicialmente adicionado a uma concentração de 2 mM) teve apenas efeitos menores ou insignificantes sobre a viabilidade de células de controlo não induzidas com plasmídeos vazios.; não houve diferença significativa na viabilidade entre estas células e os controlos do hospedeiro que não foram expostos a TCP nem IPTG. Isto foi inesperado porque foi relatado que o TCP inibe fortemente as células em crescimento de E. coli BL21 (DE3) e hospedeiros naturais como A. radiobacter AD1 ou Pseudomonas putida MC4, mesmo em concentrações 50% inferiores às utilizadas aqui . Por outro lado, o efeito prejudicial da IPTG foi estatisticamente significativo (P < 0, 01) (Fig. 2b e Ficheiro adicional 1: Fig. S2). A observação mais marcante foi que a viabilidade relativa das células pré-induzidas com IPTG e depois expostas ao TCP foi quase 90% inferior à dos controlos do hospedeiro expostos a nenhuma substância (P < 0, 01) (Fig. 2b). Esta perda dramática de viabilidade não corresponde a uma simples soma dos efeitos individuais dos dois compostos; é óbvio que a IPTG exacerbou a toxicidade do TCP. O facto de a IPTG ter exacerbado a toxicidade do TCP e não vice-versa foi confirmado através do revestimento de três recombinantes que apresentam a via de biodegradação sintética (Fig. 2b). Porque estas degraders tinham caminhos funcionais para a degradação TCP, eles eram mais capazes de tolerar sua presença. Mais importante ainda, quanto mais rápida for a conversão do TCP pelas enzimas da Via, maior será a viabilidade dos degrers. Deg31opt, que alcançou uma rápida conversão inicial de TCP, mas acumulou quantidades significativas dos intermediários DCP e GDL, sobreviveu à incubação de 5 h quase bem como o controle do hospedeiro que não foi exposto ao substrato. Estes dados são consistentes com os resultados previamente relatados dos testes de paragem do crescimento, que indicaram que o TCP é o composto mais tóxico da via .A avaliação da carga metabólica e dos efeitos da toxicidade do substrato por citometria de fluxo multi-parâmetros

a citometria de fluxo multi-parâmetros permite a determinação simultânea de várias variáveis bioquímicas e físicas imediatamente após a preparação da amostra e, por conseguinte, deve fornecer informações mais precisas sobre o estado fisiológico das células do que as obtidas por revestimento . Esta técnica também oferece informações-chave sobre a heterogeneidade das populações bacterianas. Ao contrário do revestimento, não subestima o número de células viáveis em culturas originais nos casos em que uma fracção da população sofreu lesões subletais e perdeu a capacidade de crescer .

a incubação das três degraders e controles do hospedeiro foi realizada nas condições mencionadas na seção anterior. As amostras retiradas após incubação de 5 h com ou sem TCP foram manchadas com iodeto de propídio (PI), 6-carboxi-2′,7′-diclorodihidrofluorocloresceína diacetato (carboxi-H2DCFDA) ou ácido bis-(1,3-dibutilbarbitúrico) trimetina oxonol . Corantes para a rotulagem de ácidos nucleicos, tais como PI, que só entra nas células com membranas comprometidas, são comumente usados com corantes potencialmente sensíveis à membrana, tais como DiBAC4(3), que se liga aos componentes intracelulares contendo lípidos, para estudar a viabilidade bacteriana . Carboxipenicilinas H2DCFDA é um quimicamente reduzidos, acetilado e carboxilada forma de fluoresceína, que tem encontrado muitas aplicações como um indicador geral para a presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) em eucarióticas e células procariontes . Estudos recentes sobre a utilização bacteriana de hidrocarbonetos alifáticos clorados sugerem que este processo está associado com forte estresse oxidativo e nós hipotetizamos que TCP também evoca tal resposta fisiológica . A saturação de ácidos graxos insaturados por halogenação ou peroxidação lipídica provoca alterações na fluidez da membrana, resultando no colapso de cadeias de transporte de elétrons e transferência de elétrons prematura para o oxigênio, acompanhada pela formação de ROS, permeabilização de membrana e morte celular .

o protocolo de citometria de fluxo de ponto final adoptado no nosso estudo foi menos sensível do que o revestimento na demonstração da carga causada pelos plasmídeos (Fig. 2b), possivelmente porque a presença de ADN heterólogo e a expressão constitutiva dos marcadores de selecção não alteraram directamente as propriedades visadas pela citometria, mas desequilibraram o estado energético global das células. No entanto, a abordagem da citometria de fluxo utilizando fluorocromos selecionados foi útil para expor os efeitos tóxicos de IPTG e TCP. Não houve diferenças significativas (P > 0.05) entre os controlos do hospedeiro não induzido com plasmídeos vazios, independentemente do seu estado de exposição ao TCP, em relação a qualquer das três variáveis examinadas nestas experiências (permeabilidade da membrana, formação de ROS e potencial de membrana; ver Fig. 2b). No entanto, a proporção de células com coloração positiva para o DiBAC4 (3) aumentou até três vezes no controlo tratado com IPTG isoladamente (P < 0, 01). O mesmo efeito foi também observado em deg31, cuja resposta à indução e incubação com TCP foi estudada com mais detalhe (Fig. 3). A fracção da população bacteriana que coloração positivamente com os três corantes aumentou muitas vezes quando o pré-tratamento com IPTG foi combinado com a exposição ao TCP, confirmando o efeito exacerbador anteriormente observado e indicando que a acção do TCP nas células bacterianas é acompanhada por uma extensa formação ROS (figos. 2b, 3). A despolarização das membranas, a acumulação de ROS e a permeabilidade das membranas foram reduzidas em recombinantes de E. coli que expressaram a via de biodegradação sintética, sendo o grau de redução proporcional às taxas iniciais de conversão TCP das estirpes. Curiosamente, a exacerbação da toxicidade composta por pré-indução do controlo do hospedeiro BL21(DE3) com a IPTG foi confirmada também em experiências com o modelo de composto tóxico hidroperóxido de terc-butilo (TBHP), um peróxido orgânico e forte formação de ROS promovendo agente oxidativo (ficheiro adicional 1: Fig. S3). Isto sugere que o fenómeno de exacerbação descrito não deve ser restringido apenas ao nosso modelo químico tóxico TCP.

a despolarização da Membrana e a formação de ROS in vivo são processos dinâmicos. Para seguir a sua cinética em degrades de E. coli, também realizámos medições com resolução temporal(ficheiro adicional 1: Fig. S4). O número de células manchadas por DiBAC4(3) e carboxi-H2DCFDA aumentou linearmente ao longo do tempo em todos os recombinantes stressados, com exceção do deg31. Curiosamente, este degrader exibiu uma explosão inicial de fluorescência de DiBAC4(3) e carboxi-H2DCFDA, mas estes sinais então platearam ou caíram ligeiramente. Assumimos que os perfis característicos de DiBAC4(3) e fluorescência carboxi-H2DCFDA para o deg31 estão ligados à sua variante única da via de biodegradação sintética e ao curso Temporal correspondente da biotransformação TCP. Em contraste com as outras estirpes, TCP, 2,3-dicloropropano-1-ol (DCP) e glycidol (GDL) estavam presentes em concentrações relativamente elevadas na mistura de reacção de deg31 entre os minutos 50 e 100 do período de medição. Isto pode ter causado toxicidade sinérgica, aumentando o número de células com membranas despolarizadas e aumentando a formação ROS. Tais efeitos articulares são comuns; têm sido observados para pesticidas organofosfatos, fluorosurfactantes e metais pesados, entre outros . A subsequente congelação ou diminuição moderada da intensidade dos sinais foi atribuída à remoção paralela de TCP e GDL e à produção de glicerol, que é conhecido por ser um eficaz protector de stress nas estirpes leveduras e tolerantes a solventes de E. coli .

a variante da via sintética presente em deg31 parecia proporcionar o melhor compromisso em termos de lidar com a toxicidade, ao mesmo tempo que convertia eficientemente TCP em glicerol inofensivo e foi, portanto, selecionada para uma investigação mais aprofundada.

Assesment of metabolic burden and substrate toxicity effects by electron microscopy

Metabolic burden and toxicity can cause changes in the morphology of bacterial hosts . Usámos, portanto, microscopia electrónica de transmissão para estudar as alterações na morfologia das células deg31 induzidas e não induzidas após incubação de 5 h com ou sem TCP de 2 mM (Fig. 3). São apresentadas imagens de células de controlo do hospedeiro de E. coli induzidas e não induzidas com plasmídeos vazios (ficheiro adicional 1: Fig. S5). Observações microscópicas foram seguidas por citometria de fluxo multi-parâmetros de células deg31 manchadas com PI, carboxi-H2DCFDA, ou DiBAC4(3).

a incubação de degradores não induzidos com TCP produziu apenas uma pequena proporção de células bacterianas mortas, e a morfologia das células tratadas desta forma não diferia geralmente da das células não expostas ao substrato tóxico (Fig. 3a, b). A proporção de células manchadas por carboxi-H2DCFDA e IP aumentou moderadamente, mas não foi observado efeito no potencial da membrana. Bactérias pré-induzidas que produzem proteínas recombinantes formaram intensivamente corpos de inclusão visíveis e mostraram separação frequente da membrana citoplasmática da membrana externa nos pólos da célula (Fig. 3c). Uma vez que a maioria das proteínas recombinantes obtidas a partir de lisatos celulares eram solúveis (dados não mostrados), acreditamos que os corpos observados consistiam em enzimas ativas.

a combinação de pré-indução e incubação com TCP produziu as alterações morfológicas mais pronunciadas e foi acompanhada por um aumento substancial do número de células manchadas positivamente para PI, carboxi-H2DCFDA e DiBAC4(3) (Fig. 3d). Numerosas células mortas ou moribundas com membranas citoplásmicas danificadas e conteúdo vazado eram claramente visíveis. Mesmo assim, uma parte significativa da população resistiu aos efeitos combinados da IPTG e da TCP durante o período de tratamento de 5 h. Isto deveu-se principalmente à via sintética bem equilibrada do deg31 e à sua rápida conversão do TCP em glicerol. A bistabilidade é um fenômeno comum e pode ser atribuída ao ruído na expressão dos traços multigênicos responsáveis pela tolerância à toxicidade e pela resposta de estresse graduada na população bacteriana . Em resumo, as nossas observações microscópicas de populações de deg31 tratadas em quatro condições diferentes foram consistentes com resultados anteriores e sustentaram a conclusão de que a pré-indução com IPTG exacerba a toxicidade TCP.

Toxicidade exacerbação do efeito aumenta em células enfrentando metabólica carga de plasmídeos

Dado que tanto o E. coli degraders e os controles de host utilizado neste trabalho teve de lidar com a carga metabólica do Dueto plasmídeos e LacIQ/P lacUV5 -T7 sistema de expressão, decidimos incluir E. coli controles sem estes componentes, a seguinte experiência. Para este efeito, utilizámos E. coli BL21 (DE3) sem plasmídeos e a estirpe de clonagem E. coli DH5a, que carece tanto do sistema de expressão LacIQ/P lacUV5-T7 como do operão lac. Ao empregar os protocolos de citometria de revestimento e fluxo descritos acima, descobrimos que o efeito de exacerbação era modesto ou completamente ausente em ambas as estirpes (ficheiro adicional 1: Fig. S6A, B). Isto sugere que o estresse duplo de IPTG e TCP só se manifesta em estirpes que transportam plasmídeos de Dueto e o sistema de expressão correspondente.

presumimos que os recombinantes estudados não poderiam suprimir eficazmente o duplo stress da IPTG e do substrato tóxico devido à carga metabólica imposta pelos plasmídeos e à correspondente escassez de recursos necessários para a manutenção celular. Parece que a estrutura química do IPTG, o seu transporte ou presença dentro da célula, desencadeia alterações fisiológicas que facilitam a manifestação da toxicidade TCP nas células de E. coli BL21(DE3) com plasmídeos de dueto.Em seguida, tentámos reduzir a carga imposta aos recombinantes E. coli, optimizando a concentração de IPTG. Buscamos a menor concentração possível de indutor que minimizaria o custo de fitness sem comprometer significativamente a eficiência do sistema em degradar o TCP. As células de Deg31 foram pré-induzidas com concentrações de IPTG variando de 0, 01 a 1, 00 mM e estudaram-se os efeitos resultantes na viabilidade celular e na eficiência da via (Fig. 4; arquivo adicional 1: Fig. S7).

E. coli BL21 (DE3) com os plasmídeos de pETDuet e pCDF vazios foi utilizado como um controlo para o revestimento para avaliar a carga imposta ao hospedeiro pela exposição IPTG na ausência da via heteróloga (Fig. 4). A viabilidade da degrada e controlo pré-induzidos foi verificada antes e após 5 h de incubação em tampão fosfato com 2 mM TCP e comparada com a das células não expostas à IPTG (Fig. 4a, b). A percentagem de células sobreviventes após incubação foi calculada em cada caso (Fig. 4c). Estas experiências indicaram que mesmo na ausência de TCP havia uma correlação inversa entre a concentração de IPTG e a viabilidade da E. coli recombinante (Fig. 4a). A estirpe deg31 sofreu mais com o aumento das concentrações de IPTG do que com o controlo, provavelmente devido ao peso adicional de expressar genes que codificam a via sintética. O oposto foi verdadeiro após 5 h de incubação porque a estirpe TCP-catabolizante deg31 era mais resistente à toxicidade exacerbada do que o controlo do hospedeiro (Fig. 4b, c). A estirpe de via sintética exibiu taxas de sobrevivência semelhantes em todas as concentrações testadas de IPTG, excepto para a mais elevada—a viabilidade relativa do deg31 pré-induzido com IPTG de 1 mM foi de 100 %. Partimos do pressuposto de que este periféricas valor foi devido à subestimação do número de células viáveis antes da incubação, devido ao intensivo de estresse experimentado pelo degrader após a indução com uma alta concentração de IPTG e a consequente presença de viáveis mas não cultiváveis células em suspensão . Os experimentos de revestimento demonstraram que uma fração da população bacteriana recuperou sua capacidade de crescer e reproduzir algum tempo após o tratamento com esta alta concentração de IPTG (arquivo adicional 1: Fig. S8).

the time-courses of TCP biotransformation with resting cells of deg31 pre-induced with IPTG at 1.00, 0.20, 0.05, 0.025, and 0.01 mM (Additional file 1: Fig. S7) e análise densitométrica de géis de poliacrilamida SDS com as amostras correspondentes de extractos sem células (ficheiro adicional 1: Fig. S9, quadro S1) demonstrou que:: (i) a relação de via de enzimas e a forma da degradação do perfil não alterar substancialmente com o indutor de concentração, enquanto (ii) o conteúdo dos três caminho de enzimas no total de proteína solúvel do recombinante bactérias diminuiu de 55 % (1 mM de IPTG) 32 % (0,01 mM IPTG) e a via de saída do reduzido de 70 para 46 %. A conversão apreciável do TCP também foi conseguida com células não induzidas devido à fuga do promotor T7 e à expressão basal dos genes dentro da Via (ficheiro adicional 1: Fig. S7).

a Figura 5 resume o balanço dos três parâmetros discutidos nas secções precedentes: (i) viabilidade do hospedeiro, (ii) expressão celular das enzimas de via e (iii) a produção da rota de biodegradação sintética. Podemos concluir que o mínimo de concentração de IPTG que permite suficientes expressão de genes dentro do caminho para alcançar um razoável de saída é de 0,025 mM. Semelhante indutor concentrações que permitam a completa expressão do gene têm sido relatados para a única proteínas recombinantes, tais como β-galactosidase, a proteína verde fluorescente, e rhamnulose-1-fosfato aldolase . Note-se que a concentração de IPTG de 0, 025 mM é oito vezes inferior à concentração de indutores inicialmente testada e até 40 vezes inferior aos valores comunicados na literatura científica que descreve a engenharia de vias heterólogas na E. coli . A indução com quantidades menores de IPTG melhorou a aptidão do hospedeiro. No entanto, mesmo a concentração mais baixa de 0,01 mM reduziu a viabilidade da degrada de E. coli em 30 % em relação ao deg31 não induzido, e em até 50% em relação ao controle do hospedeiro não induzido (P < 0,05 em ambos os casos; Fig. 4b). Por conseguinte, investigámos a possibilidade de substituir a IPTG por um indutor alternativo.

Reduzir a carga metabólica e toxicidade exacerbação induzindo com lactose

Lactose é um indutor natural do operon lac e pode ser empregado como uma alternativa mais barata para sintético de IPTG. Provou-se que induz a expressão de proteínas recombinantes na E. coli na mesma medida que a IPTG, tanto a nível laboratorial como industrial . Em contraste com IPTG, a lactose é um substrato Da β-galactosidase (codificada por lacZ) e, portanto, pode ser metabolizada por células com um operão de laca intacto, incluindo E. coli BL21(de3). Por conseguinte, as concentrações de lactose até 30 mM são frequentemente utilizadas para induzir a expressão de genes clonados a níveis que podem ser atingidos com ≤1 mM de IPTG .Investigámos a pré-indução de células de deg31 com lactose de 1 mM. Assumimos que esta concentração seria suficiente para induzir a expressão dos genes das vias de degradação TCP a níveis que conferissem uma eficiência adequada de degradação. Esta expectativa foi confirmada pelo registo de ciclos temporais de biotransformação TCP e pela constatação de que as enzimas de vias representavam até 41% da proteína solúvel total das células nestas condições (ficheiro adicional 1: figos. S7 e S9, e quadro S1). A conversão teórica de TCP em glicerol nestas Condições foi de 63%. Estes valores estão próximos dos observados para as células deg31 pré-induzidas com 0, 025 ou 0, 05 mM de IPTG. Mais importante ainda, as células deg31 pré-induzidas com lactose exibiram maior viabilidade antes e depois de 5 h de incubação com TCP em comparação com bactérias tratadas com IPTG em qualquer uma das concentrações testadas (P < 0, 05; Fig. 4). O mesmo efeito de alívio foi observado para o controle do hospedeiro. Em termos de sobrevivência, as células pré-induzidas com lactose realizaram quase bem como os seus homólogos não induzidos (Fig. 4c). Em consonância com o chapeamento de resultados, análise por citometria de fluxo de controle de host e deg31 células pré-induzidos com lactose revelou níveis significativamente inferiores de sublinhou células com despolarizada membranas do que foi observado para E. coli, cepas de pré-induzida com IPTG (P < 0.01; de arquivo Adicionais 1: Fig. S10). Estes resultados indicaram novamente que a acção da IPTG nos recombinantes estudados foi consistentemente acompanhada por alterações nas propriedades da membrana.

uma maior viabilidade das células induzidas com lactose em vez de IPTG foi anteriormente relatada para a expressão de proteínas heterólogas únicas . Este efeito foi atribuído à indução mais lenta e atrasada obtida com o indutor natural. Em contraste com o iptg sintético, que pode entrar rapidamente na célula tanto por difusão passiva como com a ajuda da permease de lactose LacY, a lactose só pode entrar no citoplasma através da permease. Além disso, a lactose deve ser convertida em alolactose pela β-galactosidase antes de se ligar ao compressor lac, enquanto que a IPTG se liga directamente ao compressor. Os nossos resultados confirmam que a lactose impõe uma carga metabólica mais baixa do que a IPTG, sugerindo que é também um indutor mais adequado para a expressão de vias heterólogas inteiras em E. coli BL21(DE3). Isto é particularmente importante para as células de E. coli BL21 (DE3) que transportam vias sintéticas que degradam compostos tóxicos ou produzem produtos intermédios tóxicos.