Fronteiras em Microbiologia

Introdução

aspergilose Invasiva (IA) é potencialmente fatais da doença, ocorrendo principalmente em pacientes gravemente imunocomprometidos, tais como aqueles com leucemia mielóide aguda, aqueles com neutropenia prolongada, devido à myelotoxic terapia, ou alogênico de células hematopoiéticas, transplante ou transplante de órgão sólido, e estima-se que afeta cerca de 200.000 pacientes por ano (Brown et al., 2012). A iniciação atempada da terapia é importante para melhorar a sobrevivência, mas o diagnóstico continua a ser notoriamente difícil, especialmente quando se baseia na cultura convencional ou microscopia (Lamoth e Calandra, 2017). Por causa disso, novos biomarcadores para o diagnóstico precoce de IA foram introduzidos ao longo das últimas duas décadas. Resumimos as vantagens e desvantagens destes testes no quadro 1. O desempenho de diagnóstico destes biomarcadores pode ser melhorado ainda mais usando-os como uma combinação de testes (Aguado et al., 2015; Neofytos et al., 2015).

A Galactomanana (GM) pertence a um grupo de polissacáridos que consistem numa espinha dorsal de manose e num número variável de cadeias laterais de galactofurano. A GM constitui uma parte importante da parede celular de Aspergillus spp. (Latgé et al., 1994). Estes polissacáridos contendo galactofuranose variam em tamanho de 35 a 200 kDa e são segregados in vivo pelo fungo durante o crescimento invasivo. Nos últimos anos, a detecção de antigénios contendo galactofuranose, incluindo GM, tem sido utilizada para diagnosticar aspergilose invasiva (IA). Até à data, o método mais utilizado para determinar a GM no soro e no líquido de lavagem broncho-alveolar (BAL) é um teste imunológico duplo ligado às enzimas de sanduíche (antigénio Platelia™ Aspergillus, Bio-Rad, Marnes-la-Cocquette, França). Este ensaio é baseado no anticorpo monoclonal IgM derivado do rato Eb-A2, que actua como anticorpo de captura e detector, e que se liga selectivamente a quatro ou mais resíduos β(1 → 5) de galactofuranosil de GM (Mennink-Kersten et al., 2004). Este ensaio é aprovado pela Food and Drug Administration dos EUA, comercialmente disponível, e foi incorporado como critério microbiológico na Organização Europeia de investigação e tratamento de Cancer-Mycosis Study Group consensus definitions of invasive fungal disease (Pauw et al., 2008). Embora este ensaio tenha sido aprovado para utilização apenas no soro e no líquido BAL, a determinação bem sucedida de GM noutras matrizes, tais como o líquido cefalorraquidiano (Chong et al., 2016), urina (Reischies et al., 2016), plasma (White et al., 2013), e fluído de abscessos (Verweij et al., 2000) também foi relatado. Os resultados são comunicados como um índice de densidade óptica (ODI), em que o valor de absorvância de uma amostra clínica é comparado com a média de duas amostras de referência (os comandos de corte) fornecidas pelo fabricante. No entanto, os níveis de absorvância só são fiáveis num dado intervalo, dependendo do tipo de fotómetro utilizado. Isto representa uma limitação importante do ensaio. A densidades ópticas mais elevadas, a relação entre a concentração de GM e o valor de absorvância torna-se não linear (Figura 1), resultando na subestimação das concentrações acima da Gama linear. Uma vez que a densidade óptica dos padrões de referência pode variar entre os ensaios, o corte no qual o ensaio se torna não-linear também pode ser variável. De acordo com as instruções do fabricante, a densidade óptica média dos comandos de corte tem de ser ≥0.300 e ≤ 0.800. Por exemplo, um fotómetro de boa qualidade com uma gama linear até uma absorvância de 2.5 Poderá, por conseguinte, comunicar com precisão um DDI entre 8,33 (para um controlo de corte médio de 0,300) e 3,13 (para um controlo de corte médio de 0,800). Em um fotômetro de baixa qualidade com uma faixa linear até uma absorvância de 1,0, este limite de quantificação confiável pode ser tão baixo quanto 1,25 (para um controle de corte médio de 0,800). Como tal, Pequenas variações de alto ODI devem ser interpretadas com cautela. Para uma determinação precisa de valores mais elevados de GM (fora da Gama linear), deve repetir-se o ELISA em amostras diluídas em série ou utilizar outros métodos mais precisos, como a espectrometria de massa. Atualmente, o fabricante recomenda um corte de 0,5 no soro e BAL. No entanto, devido ao grande número de falsos positivos no BAL neste corte, um corte maior de 1.0 é proposto na próxima revisão do critério EORTC-MSG.

as características do ensaio e as limitações da detecção de GM para o diagnóstico da IA foram bem estudadas e foram objecto de várias meta-análises (Pfeiffer et al., 2006; Zou et al., 2012; Leeflang et al., 2015). Além de fornecer informações sobre o diagnóstico, a GM sérica (sGM) também foi explorada para prever o resultado após o início do tratamento, em particular porque o teste é fácil de realizar, amplamente disponível, em grande parte Aspergillus específico, padronizado e objetivo. No entanto, a concentração de sGM in vivo é determinada não só pela taxa de produção e secreção pelo fungo em crescimento, mas também pela taxa de absorção na corrente sanguínea, bem como pela taxa de eliminação da circulação.

devido à grande dimensão relativa da GM, o antigénio não pode ser facilmente difuso a partir dos alvéolos através do revestimento endotelial dos capilares pulmonares; é necessária uma angio-invasão para atingir a circulação. Isto foi confirmado num modelo in vitro de alvéolos humanos, no qual a GM só apareceu na corrente sanguínea após o crescimento invasivo de Aspergillus através da membrana alveolar-capilar (Hope et al., 2007). Obviamente, como claramente demonstrado em estudos histopatológicos e estudos quantitativos de reação em cadeia da polimerase (PCR), o grau de angio-invasão (e, portanto, fungos carga) varia de acordo com a natureza da condição subjacente, com a invasão maciça e uma alta carga fúngica no neutropénicos modelos e predominantemente inflamação com pouco invasão e uma baixa carga fúngica no induzida por esteróides modelos (Sheppard et al., 2006). A produção de GM é ainda influenciada pela terapêutica, o que explica a diminuição da sensibilidade da detecção da GGM em doentes a receber terapêutica com mofo-activa (Leeflang et al., 2015). Este achado foi confirmado em modelos animais, onde um efeito dependente da concentração na detecção de sGM foi mostrado para triazóis, polienos e drogas de investigação, tais como os orotomides (Petraitiene et al., 2001; Petraitis et al., 2016; Kimura et al., 2017; Negri et al., 2017). Um modelo demonstrou um aumento paradoxal da MGP após o tratamento com caspofungina (Petraitieno et al., 2002), potencialmente devido a interferência com a síntese de células fúngicas. No entanto, outros modelos utilizando equinocandinas não conseguiram replicar este fenómeno (Miceli e Anaissie, 2007). É mais provável que o “efeito paradoxal” tenha sido causado por uma terapêutica ineficaz, resultando num aumento da carga fúngica, em vez de um aumento da libertação da parede celular, uma vez que foi demonstrado que as equinocandinas têm uma actividade limitada contra Aspergillus spp. em humanos (Viscoli et al., 2009). Na maioria dos modelos animais comparativos, não se observou diferença na cinética da GGM entre diferentes fármacos antifúngicos quando comparados com o mesmo nível de eficácia.

a eliminação da GGP ocorre por diferentes vias in vivo. Usando radioativamente o nome A. fumigatus GM, um modelo de IA de rato e coelho, mostrou uma concentração hepática de cerca de um terço da dose inicialmente injectada através da absorção nas células de Kupffer (Bennett et al., 1987). O receptor de manose macrófago desempenha um papel central neste processo, uma vez que a captação hepática foi diminuída após a administração de inibidores deste receptor (Bennett et al., 1987). Outro terço foi excretado por via renal dentro de 24 horas, o que está de acordo com o aparecimento de GM na urina de doentes com IA (Reischies et al., 2016). A depuração Renal também depende da função renal (e do tamanho da molécula), como é ainda evidenciado por um relatório de caso de IA em um doente em hemodiálise que tinha níveis crescentes de sGM, apesar do tratamento adequado e melhoria clínica (Saleeby et al., 2005). Por último, acredita-se que os neutrófilos estejam também envolvidos na absorção e eliminação da GM circulante. Isto explicaria a sensibilidade significativamente maior da detecção da GGP em doentes neutropénicos em comparação com os não neutropénicos (Pfeiffer et al., 2006). Além disso, um modelo de coelho confirmou que os níveis mais baixos de sGM aparecem em coelhos não neutropénicos, em comparação com coelhos neutropénicos, enquanto que não se detectou qualquer diferença na GM no fluido BAL (Petraitieno e outros., 2015). Assim, a interacção entre a produção e a secreção durante o crescimento invasivo, o tamanho da carga fúngica, a terapêutica anti-bolor, a função renal e hepática e o estado de neutropenia, resulta num perfil cinético complexo para a MGP.

Para determinar o estado atual da arte e o papel do GM e sua cinética no resultado do IA, procuramos na base de dados MEDLINE, através da Pubmed, utilizando a seguinte consulta estruturada: (“galactomanano” OU “galactomanano”) E (“prognóstico” OU “prognóstico” OU de resposta, OU “terapia” OU “terapia” OU “tratamento” OU “terapêutica” OU “terapêutica” OU “resultado”). De um total de 911 artigos, 56 artigos foram selecionados com base no título e abstrato.

Cinética em seres Humanos

conseguimos identificar quaisquer dados sobre a cinética do sGM após a sua administração a voluntários saudáveis, o que nos permitiria uma exploração detalhada da sua cinética e o metabolismo. No entanto, diferentes fontes de falsa positividade (tais como soluções eletrolíticas contendo GM ou antibióticos beta-lactâmicos) permitem alguma visão de sua cinética no corpo humano. Um estudo analisou a sGM após perfusão de antibióticos beta-lactâmicos em doentes que eram anteriormente seronegativos GM e que foram considerados não ter IA com base em sinais e sintomas clínicos – radiológicos (Aubry et al., 2006). Após a perfusão, foi observado um aumento súbito da GGP. Com base na diminuição dos níveis de sGM posteriormente, os autores estimaram uma semi-vida sérica de 2,4 dias para eliminar a sGM. No entanto, não foram notificados casos que influenciaram parâmetros como a depuração da creatinina e a contagem de neutrófilos. Huurneman et al propôs um modelo farmacocinético para a evolução da MGP durante a terapêutica antifúngica (Figura 2), baseado num pequeno número de doentes pediátricos com IA a receber voriconazol com monitorização terapêutica do fármaco (Huurneman et al., 2016). Este modelo mostrou um bom ajuste com os valores reais, mas foi limitado pelo número muito pequeno de medidas sGM reais, inclusão de possíveis casos de IA, e não levando em conta as três diferentes vias metabólicas (rim, fígado, e neutrófilos).

Impacto da GM na linha de Base no Resultado

identificamos 16 estudos que analisaram o GM na linha de base como um preditor de resposta e sobrevida (Tabela 2). Todos os estudos incluídos utilizaram o teste do antigénio de Aspergillus Platelia™, embora em cortes diferentes. Todos os estudos incluíram doentes adultos com IA comprovada e provável, salvo indicação em contrário na tabela. Não conseguimos identificar resultados conflitantes entre os artigos: tanto resultados estatisticamente significativos quanto tendências não significativas apontaram na mesma direção.

no geral, houve uma forte e consistente correlação entre o nível de sGM e sobrevivência a curto e longo prazo, desde o dia 42 até o dia 180. De fato, um bem realizado estudo prospectivo e randomizado comparando anidulafungin em combinação com voriconazol para voriconazol sozinho encontrados linha de base sGM ser apenas um dos três preditores independentes de semana de 6 de sobrevivência na análise multivariada (Marr et al., 2015). Estratificação dos doentes pela positividade da GGP inicial (utilizando um corte de 0.5) Os doentes dividiram-se em dois grupos, com doentes positivos para a mgg com mortalidade significativamente mais elevada (Fisher e outros., 2013; Hoyo et al., 2014; Kim et al., 2014; Neofytos et al., 2015; Jung et al., 2017). Três grupos determinaram um corte diferente de sGM ≥ 2.0 com base no Índice de Youden ou na análise da área sob a curva (Fisher et al., 2013; Mikulska et al., 2013; Imbert et al., 2016). Quando estratificados por este corte, dois estudos encontraram uma tendência para maior mortalidade por todas as causas 42 e 90 dias (Mikulska et al., 2013; Imbert et al., 2016), com outro estudo mostrando uma diferença estatisticamente significativa tanto para a mortalidade respiratória de 6 semanas, mortalidade respiratória de 180 dias, como para a mortalidade por todas as causas de 180 dias (Fisher et al., 2013).

esta relação demonstra a interacção entre dois factores que determinam a progressão da doença fúngica. Como demonstrado anteriormente, a sGM correlaciona-se com a carga fúngica. Como tal, uma maior carga fúngica (ou maior icgm inicial) pode ser esperado para resultar em piores resultados. Por outro lado, existe a ligação entre os neutrófilos e os GM, sendo os neutrófilos necessários para a remoção tanto do MGM como do próprio fungo. Com efeito, demonstrou-se que o sGM mais elevado no diagnóstico está correlacionado com o número de neutrófilos mais baixo (Jung et al., 2017).

um estudo também relatou uma ligação significativa entre a sobrevivência BAL GM e a semana 6 (López-Medrano et al., 2016). No entanto, a relação entre a BAL GM e o resultado deve ser interpretada com precaução, uma vez que outros não puderam replicar esta conclusão. Note – se que os testes BAL GM dependem do local de infecção, do local de amostragem (erro de amostragem), da coleção não padronizada de fluido BAL, bem como da porção de fluido BAL testada (Racil et al., 2011).

impacto da cinética GM no resultado

identificámos 21 estudos que consideraram a cinética GM como predictor da resposta e sobrevivência. Foram excluídos quatro estudos descritivos devido à falta de uma análise estatística (Kwak et al., 2004; Maertens et al., 2005; Suankratay et al., 2006; Lai et al., 2007). O restante foi resumido no quadro 3. Todos os estudos incluídos utilizaram o ensaio do antigénio de Aspergillus Platelia™. Todos os estudos incluíram doentes adultos com IA comprovada e provável, salvo indicação em contrário na tabela.

tal como com a MGP inicial, parece existir uma correlação significativa entre a evolução da MGP após a linha de base e o resultado. A maioria dos estudos estratificou os doentes por resultado (resposta ao tratamento ou Sobrevivência) e encontrou diferenças significativas nos valores médios da mgg em vários pontos temporais (Woods et al., 2007; Maertens et al., 2009; Nouér et al., 2011, 2012; Park S. H. et al.= = Ligações externas = = , 2011; Han et al., 2015; Neofytos et al., 2015; Vehreschild et al., 2017). Os estudos que tiveram em conta o valor inicial de mgg e que avaliaram a taxa de declínio, também consideraram que este era um bom prognóstico do resultado (Boutboul et al., 2002; Koo et al., 2010; Khanna et al., 2013; Chai et al., 2014; Teering et al., 2014; Neofytos et al., 2015). Por exemplo, um aumento da sGM valores na semana 2 ≥1.0 sobre o valor de linha de base, previsto na falha terapêutica na semana 6 com uma sensibilidade de 66%, uma especificidade de 87% e um valor preditivo positivo de 94% (Boutboul et al., 2002). Os autores escolheram o corte de 1,0 como eles determinaram que esta é a menor variância significativa em índices ópticos mais elevados. Além disso, um sGM persistentemente negativo foi fortemente associado com bons resultados (Neofytos et al., 2015). Num outro estudo, um composto de 1,3-β-D-glucano sérico normalizado (BDG, outro biomarcador de IA) e MGM (utilizando escores z) previu a resposta clínica na semana 6 e na semana 12 (Neofytos et al., 2015). No entanto, esta situação parece dever-se inteiramente à cinética da sGM, uma vez que a BDG isoladamente não conseguiu prever qualquer uma delas, enquanto que a diferença da sGM entre o valor basal e a semana 2 previu a resposta clínica na semana 6 e na semana 12. Nenhum estudo foi capaz de identificar diferenças na GGP antes da primeira semana.

Chai et al. encontrou perfis cinéticos distintos dependendo do tratamento antifúngico, com o tratamento com voriconazol mostrando uma depuração mais precoce da SGG do que o tratamento com anfotericina B (Chai et al., 2014). No entanto, isto está em contraste com modelos animais em que não se observou qualquer diferença na cinética da MGP entre o tratamento com azole e polieno (Petraitieno et al., 2001). Além disso, outro estudo realizado em 93 doentes não encontrou diferenças nos perfis entre os fármacos antifúngicos utilizados (Koo et al., 2010).

Impact of Other Biomarkers on Outcome and Survival

alem da GM, other quantitative biomarkers are being used for diagnosing IA such as BDG and Aspergillus PCR. Estes poderiam, portanto, teoricamente, oferecer informações complementares sobre prognóstico e resposta à terapia, uma vez que têm diferentes fontes de produção e eliminação. Na verdade, um BDG em declínio na semana 2 demonstrou estar correlacionado com a sobrevivência na semana 6 e na semana 12 (Neofytos et al., 2015). No entanto, este declínio foi mais lento do que o declínio na MGP, e foi menos sensível para prever a resposta da terapêutica. A taxa de declínio parece ter um impacto na sobrevivência, no entanto, um declínio no BDG níveis de 2.51 pg/mL/dia tinha uma sensibilidade de 73.5% e especificidade de 83,5% para a previsão de sobrevivência (Pini et al., 2016). As concentrações de soro de bis(methylthio)gliotoxin (bmGT), um metabólito secundário de Aspergillus que tem sido proposto como uma complementares biomarcador, mostrou-se significativamente maior nos pacientes que morreu no dia 30 (2.36 ± 4.76 vs. 1,4 ± 7.58 mg/L, p < 0.01; Vidal-García et al., 2016).

num outro estudo, um Aspergillus PCR quantitativo demonstrou uma boa correlação entre o número inicial de cópias e a mortalidade de 90 dias, bem como entre a positividade persistente da PCR após 2-3 semanas e a mortalidade de 30 e 90 dias (Imbert et al., 2016). Similarmente, um declínio no ARN Aspergillus circulante entre a semana 4 e a semana 6 correlacionou-se fracamente com a resposta da semana 12 (κ = 0, 621, p = 0, 026) mas não com a resposta da Semana 6 (Zhao et al., 2016). Não foi possível encontrar uma relação entre a sGM e o ARN Aspergillus circulante. Como tal, estes biomarcadores não-GM parecem ser especialmente úteis em pacientes negativos sGM, mas são superados pela sGM em pacientes positivos sGM (que têm um prognóstico pior desde o início), e só permitem a avaliação da eficácia antifúngica durante as fases posteriores do tratamento.O que se segue?

os dados até agora indicam uma forte correlação entre a MGP inicial e o resultado, bem como entre a cinética da MGP e o resultado. No entanto, estas correlações baseiam-se em valores médios de MGP e oferecem pouco valor acrescentado para a gestão do paciente individual, principalmente devido à falta de limiares específicos. Portanto, vários autores propuseram regras de decisão clínica com base em seus achados. No entanto, falta a validação destas regras propostas, tanto na população inicial de que foram derivadas, como nas populações externas de validação. Como tal, não estão disponíveis indicadores exatos da exatidão, sensibilidade, especificidade e outros parâmetros, tornando estas regras de decisão propostas ainda não adequadas para uso na prática clínica diária. Além disso, dos estudos acima discutidos que utilizaram o Aspergillus ELISA Platelia™, nenhum abordou a questão da não linearidade de níveis mais elevados de MGP. Vários estudos têm aplicado modificações nas definições de consenso EORTC-MSG, principalmente incluindo outros critérios hospedeiros, tais como AIDS, cirrose e doença pulmonar obstrutiva crônica, e outros critérios clínicos, tornando mais difícil a comparação e interpretação dos resultados. Além disso, muitos estudos sofrem de um número baixo a muito baixo de amostras de sGM por paciente. Isto às vezes é contornado por modelagem da cinética média de sGM na população, e usando este modelo para prever o valor esperado em um determinado ponto de tempo baseado em valores anteriores. A estimativa resultante é então utilizada para uma análise mais aprofundada. Ambas as abordagens são inerentemente sujeitas a viés, pois os valores reais no momento do interesse são desconhecidos.

Actualmente, os ensaios clínicos que avaliam os fármacos antifúngicos utilizam principalmente a sobrevivência na semana 6 ou na semana 12 como resultado primário, ou a resposta clínica conforme definida nos critérios EORTC-MSG (Segal et al., 2008). Foram propostos resultados substitutos para uma avaliação anterior da eficácia, que potencialmente permitiria uma duração mais Curta dos ensaios clínicos. Um desses parâmetros define sucesso como sGM repetidamente negativo (<0, 5) durante pelo menos 2 semanas após o primeiro sGM negativo. Isto mostrou uma boa correlação com a sobrevivência em 56 doentes hematológicos (coeficiente de correlação kappa 0, 861, p < 0, 0001), que está de acordo com o que seria esperado dos dados cinéticos acima descritos (Woods et al., 2007). Este resultado foi confirmado por três estudos independentes em doentes hematológicos, todos os quais encontraram coeficientes de correlação kappa semelhantes entre este marcador substituto e o resultado clínico e a sobrevivência (Maertens et al., 2009; Nouér et al.= = Ligações externas = = , 2011). No entanto, esta definição não permite a avaliação da eficácia num objectivo pré-determinado (por exemplo, após 1 ou 2 semanas de tratamento), o que pode ser muito útil para orientar a tomada de decisões. Neste contexto, ainda não está disponível um marcador substituto inicial robusto e adequadamente validado.

embora a sensibilidade da GGP para o diagnóstico de IA seja menor em doentes não neutropénicos, receptores de transplantes de órgãos sólidos e doentes com profilaxia antifúngica activa do molde, as propriedades prognósticas da GGP não parecem ser influenciadas por esta situação. Vários estudos incluíram doentes não neutropénicos ou receptores de transplantes de órgãos sólidos (Koo et al.= = Ligações externas = = , 2011; Russo et al., 2014; Teering et al., 2014; Neofytos et al., 2015; Imbert et al., 2016; Jung et al., 2017), ou olhou para estas populações exclusivamente (Hoyo et al., 2014; Heylen et al., 2015; López-Medrano et al., 2016). Os resultados destes estudos estavam de acordo com os resultados de Estudos em doentes hematológicos. Não foi possível identificar quaisquer estudos que analisassem a diferença de cinética entre os doentes em profilaxia antifúngica activa do mofo. No entanto, vários estudos incluídos nesta população, em sua análise global (percentagem da população de estudo em molde-ativo profilaxia antifúngica: intervalo 4.3–85%, mediana de 50%), e encontraram resultados semelhantes aos de populações não na profilaxia (Parque de S. Y. et al., 2011; Hoyo et al., 2014; Kim et al., 2014; López-Medrano et al., 2016; Jung et al., 2017). Podemos concluir, assim, que os pacientes com mgg inicial alta, e os pacientes com mgg que não diminuem, ainda estão em maior risco de desfecho ruim, independente da condição subjacente ou profilaxia. No entanto, a cinética exata pode diferir entre essas populações diferentes, e não foram estudados em detalhes.

conclusão

MGP inicial e as tendências da cinética da MGP correlacionam-se com o resultado (resposta e sobrevivência) na IA. Além disso, a sGM parece ter potencial prognóstico precoce, especialmente em pacientes hematológicos. No entanto, são urgentemente necessários estudos adicionais para determinar os pontos de paragem precisos clinicamente relevantes e as suas características de teste, seguidos de validação em populações hematológicas e não hematológicas. Além disso, vários outros biomarcadores, tais como BDG, bmGT e DNA ou RNA de Aspergillus, parecem oferecer informações adicionais e complementares, embora a quantidade de evidência para esses biomarcadores seja ainda escassa.

Autor Contributions

TM was involved in data collection and drawing the article. TM, EG, KL e JM estiveram envolvidos na revisão crítica do artigo e aprovação final da versão a ser publicada.

Declaração de conflito de interesses

TM recebeu lições honorárias de Gilead e apoio de viagens de MSD e Gilead. A JM recebeu bolsas de pesquisa, apoio de viagens e palestras de Gilead, MSD, Basilea Pharmaceuticals, Astellas e Pfizer e participou em conselhos consultivos para MSD, Gilead, Astellas, Basilea, Pfizer, F2G, Amplyx, Scynexis e Cidara. KL recebeu bolsas de pesquisa, apoio de viagens e palestras honoraria de Gilead, MSD e Pfizer. Ela participou de conselhos para MSD e Gilead.O outro autor declara que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.