Gel Filtração Cromatografia

Gel Filtração Cromatografia de Aplicações

Gel de filtração de cromatografia, um tipo de cromatografia de exclusão de tamanho, pode ser usado para fractionate moléculas e complexos em uma amostra em frações com uma determinada faixa de tamanho, para remover todas as moléculas maiores que um determinado tamanho de amostra, ou uma combinação de ambas as operações. A cromatografia de filtração em Gel pode ser usada para separar compostos como pequenas moléculas, proteínas, complexos proteicos, polissacáridos e ácidos nucleicos quando em solução aquosa. Quando um solvente orgânico é usado como a fase móvel, o processo é em vez disso referido como cromatografia de permeação em gel.

a cromatografia de filtração em Gel também pode ser utilizada para:

• Fracionamento de moléculas e complexos dentro de uma determinada faixa de tamanho
• Tamanho análise e determinação
• Remoção de proteínas grandes e complexos
• Buffer exchange
• Dessalinização
• Remoção de pequenas moléculas, tais como nucleotídeos, primers, tintas, e contaminantes
• Avaliação de exemplo de pureza
• Separação de dependente independente de radioisótopos

Gel filtração cromatografia de mídia para todas as utilizações acima estão disponíveis em pré-moldados de fluxo por gravidade colunas, rotação de colunas, de baixa pressão e colunas para cromatografia de média pressão e resinas engarrafadas.

mecanismo de cromatografia de Filtração em Gel

numa coluna de cromatografia de filtração em gel, a fase estacionária é composta por uma matriz porosa e a fase móvel é o tampão que flui entre as esferas da matriz. As contas têm um intervalo de tamanho definido de poros, conhecido como o intervalo de fraccionamento. Moléculas e complexos que são muito grandes para entrar nos poros permanecem na fase móvel e se movem através da coluna com o fluxo do buffer. Moléculas menores e complexos que são capazes de se mover para os poros entram na fase estacionária e se movem através da coluna de filtração de gel por um caminho mais longo através dos poros das contas.

qualquer molécula ou complexo que esteja acima da Gama de fraccionamento para uma coluna de cromatografia em gel em particular irá mover-se através da coluna mais rapidamente do que qualquer molécula que possa entrar na fase estacionária. Portanto, qualquer constituinte na amostra que está acima do intervalo de fraccionamento irá eluir primeiro (no volume vazio) antes de qualquer coisa que está no intervalo de fraccionamento. O tamanho mínimo que permanecerá na fase móvel e não entrará na fase estacionária é conhecido como o limite de exclusão. Bio-Rad oferece cromatografia de filtração em gel e colunas com limites de exclusão que variam em mais de três ordens de magnitude, de 100 daltons a 100 mil daltons (100 kDa).Moléculas e complexos que podem entrar na fase estacionária serão fraccionados de acordo com seus tamanhos. Moléculas menores migram profundamente para os poros e serão retardadas mais do que moléculas maiores que não entram tão facilmente nos poros, e são assim eludidas da coluna mais rapidamente. Esta diferença na migração de poros leva ao fraccionamento de componentes por tamanho com o maior eluição primeiro.

em colunas de cromatografia de filtração em gel concebidas para dessalinização, troca de tampão, e a remoção de pequenas moléculas tais como nucleótidos, os sais e compostos pequenos entram facilmente nos poros, são retardados, e migram mais lentamente através da coluna do que as proteínas maiores ou ácidos nucleicos. Assim, os componentes de interesse na amostra são eluidos antes de sais, nucleótidos, etc. Os kits de limpeza de ADN que utilizam este mecanismo contêm frequentemente colunas de spin para filtração de gel.

resolução, aqui definida como a nitidez dos limites entre as frações de tamanho, é determinada pelo tamanho da conta e um número de outros fatores. O tamanho menor do bico geralmente dá maior resolução em uma coluna de cromatografia de filtração em gel. Moléculas compactas se difundiram através da fase estacionária mais rápido que moléculas lineares. Exclusão de tamanho, intervalo de fraccionamento, e taxa de eluição são afetados pela composição do tampão, força iônica, e pH. para o fraccionamento de misturas complexas de proteínas, os tempos de eluição e limites de exclusão de tamanho podem precisar ser determinados empiricamente.Um critério importante para a cromatografia de filtração em gel é que o meio é inerte e que nada na amostra ou qualquer tampão se liga ao meio. Outra consideração é o tipo de coluna de filtração em gel que está sendo usada e se ela é usada em um sistema de cromatografia pressurizada ou fluxo de gravidade ou colunas de spin. Se estiver a ser utilizado um sistema de cromatografia pressurizada, tanto a coluna como o meio devem ser capazes de tolerar a pressão e os caudais utilizados.

os meios habitualmente utilizados para cromatografia de filtração em gel baseiam-se em contas de agarose ou poliacrilamida, dextrose para sistemas de gravidade ou de baixa pressão e resinas poliméricas para sistemas de média pressão. A escolha do meio depende das propriedades dos componentes a serem separados e de outros fatores experimentais. Na determinação da escolha do meio cromatográfico de filtração em gel, são considerações gerais as seguintes::

• Fracionamento do intervalo
• exclusão de Tamanho limite
• pressão de operação
• taxa de Fluxo
• Exemplo de viscosidade
• faixa de pH
• Autoclavability
• Tolerância para a água: miscível em solventes orgânicos; alguns exemplos podem ser mais solúvel em água orgânica mix
• Tolerância para detergentes, chaotropic agentes, formamide, etc.
• temperatura de funcionamento

os tipos de amostras, a escolha do meio e a configuração do sistema cromatográfico determinarão quais os parâmetros mais importantes para uma dada aplicação de purificação.