um código genético similar é usado pela maioria dos organismos na Terra, mas diferentes organismos têm diferentes preferências para os codões que eles usam para codificar aminoácidos específicos. Isto é possível porque existem 4 bases (A, T, C e G) e 3 posições em cada codão. Existem, portanto, 64 codões possíveis, mas apenas 20 aminoácidos e 3 codões de paragem para codificar deixando 41 codões não contabilizados. O resultado é redundância; múltiplos codões codificam aminoácidos únicos. Restrições evolutivas moldaram quais codões são usados preferencialmente em que organismos-organismos têm viés de Uso do codon.
pode encontrar muitas tabelas de codon mostrando quais codões codificam quais aminoácidos (ver exemplo à direita). Com regras tão simples, pode pensar que é fácil criar uma sequência de ADN viável para codificar o seu peptídeo de interesse e produzir esse peptídeo no seu organismo de escolha. Infelizmente, as preferências de codon fazem com que não se possa escolher entre os possíveis codões aleatoriamente e esperar que a sua sequência se expresse bem em qualquer organismo.
então quais são as restrições evolucionárias que levam a essas preferências e o que podemos fazer sobre elas? Leia para descobrir!
por que os organismos têm diferentes preconceitos de Uso do codão?
as razões para várias preferências de codon entre os organismos não são completamente compreendidas, mas algumas possíveis razões incluem::
- pressões metabólicas-é preciso recursos celulares para produzir tRNAs que reconhecem diferentes codões, modificam os tRNAs corretamente, e carregam os tRNAs com os aminoácidos apropriados. Se um organismo usa apenas um subconjunto de codões, ele só precisa produzir um subconjunto de tRNAs carregadas e, portanto, pode precisar de menos recursos para todo o processo de tradução. Por exemplo, em condições de elevada taxa de crescimento, a E. coli aumenta preferencialmente a produção de tRNAs que reconhecem os codões encontrados em genes altamente expressos (Emilsson e Kurland, 1990).
- controlar a expressão genética através de sequências genéticas – proteínas que são codificadas por codões com baixa abundância ou tRNAs mal carregadas podem ser produzidas a uma taxa inferior às proteínas codificadas por tRNAs altamente abundantes e carregadas. Por exemplo, Tuller et al. descobriu-se que a eficiência de tradução está bem correlacionada com o viés de codon tanto em E. coli e S. cerevisiae.
- dobragem de proteínas-se uma proteína é codificada por uma mistura de codões com tRNAs altamente e mal carregadas, diferentes regiões da proteína podem ser traduzidas a taxas diferentes. O ribossoma irá mover-se rapidamente ao longo de regiões que exigem tRNAs abundantes e carregadas, mas vai parar em regiões que exigem pouca abundância, tRNAs mal carregadas. Quando o ribossomo pára, isso pode dar às regiões rapidamente traduzidas uma chance de dobrar corretamente. Por exemplo, Pechmann e Frydman descobriram que os traços de codões não ótimos estão associados a estruturas secundárias específicas em 10 estirpes de levedura estreitamente relacionadas.
- adaptação à mudança de condições-os organismos necessitam frequentemente de expressar genes a diferentes níveis em diferentes condições. Com o uso variado de codon, um organismo pode mudar quais proteínas são altamente expressas e que são mal expressas pela produção e carregamento de piscinas tRNA específicas. Por exemplo, as tRNAs usadas em genes que codificam enzimas biossintéticas de aminoácidos podem ser carregadas preferencialmente durante a fome de aminoácidos, resultando em maior produção de enzimas biossintéticas de aminoácidos (Dittmar et al., 2005).
como é que o uso do codon afecta as minhas experiências?Embora as preferências de codon possam ser muito úteis para organismos, elas podem ser problemáticas para pesquisadores que tentam expressar proteínas em hospedeiros heterólogos. Se você simplesmente amplificar um gene de interesse do genoma humano, por exemplo, ele pode não se expressar de todo em E. coli (você pode encontrar uma variedade de bases de dados mostrando as preferências de vários organismos codon on-line). Mesmo que o gene seja traduzido, ele pode não funcionar corretamente. Este é o resultado de um desfasamento entre a preferência de codon humana e E. coli. Alguns codões comumente usados em humanos não são de todo comuns em E. coli e vice-versa. Ao traduzir estes codões, o ribossoma pode, portanto, empatar em locais inadequados ou não conseguir fazê-lo através de toda a transcrição, resultando na produção de proteínas não funcionais e fragmentos de proteínas, respectivamente.
a Solução do problema do uso de codons viés – codão de otimização e a expressão de alternativas de tRNAs
otimização de Códons
Com baixo custo de síntese de DNA, uma das principais formas de pesquisadores resolver o problema de codões escolha é resynthesize genes de tal forma que seus códons são mais apropriadas para o desejado expressão de host. Isto é conhecido como ” otimização de codões.”Embora simples em teoria, isso não é tão fácil quanto parece. Mesmo para peptídeos relativamente curtos, pode haver muitas maneiras possíveis de codificá-los e o que constitui o codon “apropriado” não é necessariamente óbvio.Você pode pensar: “disparate! Eu deveria apenas escolher o codon com a maior quantidade de tRNAs carregadas no meu organismo hospedeiro para cada aminoácido que eu gostaria de codificar, ” mas, como descrito acima, nem todas as regiões de uma proteína devem necessariamente ser traduzidas rapidamente para produzir uma proteína que funcione corretamente.Pode-se então pensar: “está bem, vou certificar-me de que a abundância dos codões que escolho para o hospedeiro corresponde à abundância dos codões usados no organismo nativo.”Esta é possivelmente uma ideia melhor e tem sido usada com sucesso no passado (Angov et al., 2008), mas ainda há muitos mais recursos a considerar ao projetar um gene completo. Uma lista não exaustiva inclui::
- Codão abundância relativa para cognato tRNA abundância
- sequências Repetitivas
- Restrição de sites
- Sequências passível de criar estruturas secundárias no RNA transcritos
- Efeitos de transcrição (lembre-se, ele não é tudo sobre a tradução – e.g. codão escolha pode interromper o fator de transcrição sítios de ligação)
Como você pode imaginar, não é fácil para os humanos de equilíbrio de todos esses fatores sobre a sua própria. Felizmente, muitos pesquisadores criaram algoritmos de otimização de codões e empresas de síntese de DNA, como o IDT e o genscript host online codon optimization tools. Tenha em mente que, só porque você otimiza um gene com uma dessas ferramentas, isso não significa necessariamente que o gene vai se expressar bem. Se você tiver boa expressão, Você também deve analisar funcionalmente a proteína produzida para garantir que ela tenha dobrado corretamente.
pode ser capaz de evitar que os seus genes de interesse sejam optimizados através da encomenda de plasmídeos contendo-os a partir de Addgene. Se um plasmídeo em Addgene contém um gene que foi codon optimizado para um determinado organismo, isto às vezes (mas nem sempre) será observado no campo de “mutação” na página plasmídea (ver plasmídeo 87904, por exemplo). Como muitos plasmídeos disponíveis A partir do Addgene agora têm dados de sequência completa, recomendamos analisar diretamente as sequências de genes para otimização de codões e adequação para o seu hospedeiro de expressão antes de usá-los em suas experiências.Se você não tiver tempo ou fundos para sintetizar uma versão otimizada do codon de seu gene de interesse, é possível sobreexpressar tRNAs de baixa abundância em seu hospedeiro de expressão e, assim, aumentar sua abundância. Por exemplo, as estirpes comerciais de E. coli de Rosetta expressam uma variedade de tRNAs que são normalmente encontradas em baixa abundância em E. coli.
a vantagem de produzir tRNAs adicionais é que você pode usar o mesmo sistema de expressão para muitos genes diferentes sem ter que criar novas construções. No entanto, devido a problemas como taxas de tradução inadequadas e potenciais efeitos sobre o crescimento celular, mesmo os hospedeiros que produzem tRNAs alternativas podem não expressar quantidades suficientes de sua proteína de interesse.
independentemente do método que escolher para ultrapassar os problemas em torno da escolha do codon, deve ter algum método para se certificar de que as proteínas que produz funcionam correctamente. A sobreexpressão pode resultar na produção de borbulhas insolúveis e não funcionais de proteínas conhecidas como corpos de inclusão que geralmente segregam com o sedimento celular durante os procedimentos de purificação. Mesmo que você produza uma grande quantidade de proteína na sua máquina de expressão de escolha, você deve realizar um teste funcional para se certificar de que a sua proteína não está formando corpos de inclusão e está dobrando corretamente.
1. Angov, Evelina, et al. “A expressão de proteína heteróloga é melhorada harmonizando as frequências de uso de codon do gene alvo com as da expressão Hospedeira.”PloS one 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PubMed Central PMCID: PMC2364656.
2. Dittmar, Kimberly A., et al. “Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.”EMBO reports 6.2 (2005): 151-157. PubMed PMID: 15678157. PubMed Central PMCID: PMC1299251.
3. Emilsson, Valur e Charles G. Kurland. “Dependência da taxa de crescimento da abundância de ARN de transferência em Escherichia coli.”The EMBO journal 9.13 (1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611. PubMed Central PMCID: PMC552224.
4. Gustafsson, Claes, Sridhar Govindarajan e Jeremy Minshull. “Codon bias and heterologous protein expression.”Trends in biotechnology 22.7 (2004): 346-353. PubMed PMID: 15245907.
5. Maertens, Barbara, et al. “Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli.”Protein Science 19.7 (2010): 1312-1326. PubMed PMID: 20506237. PubMed Central PMCID: PMC2970903.
6. Pechmann, Sebastian e Judith Frydman. “A conservação evolucionária da otimalidade do codon revela assinaturas ocultas de dobragem de co-translação.”Nature structural & molecular biology20. 2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PubMed Central PMCID: PMC3565066.
7. Quax, Tessa EF, et al. “Codon bias as a means to fine-tune gene expression.”Molecular cell 59.2 (2015): 149-161. PubMed PMID: 26186290. PubMed Central PMCID: PMC4794256.
- esta revisão fornece uma grande visão geral do viés de uso de codon
8. Tuller, Tamir, et al. “A eficiência de tradução é determinada pelo viés do codon e pela energia dobrável.”Proceedings of the National Academy of Sciences 107.8 (2010): 3645-3650. PubMed PMID: 20133581. PubMed Central PMCID: PMC2840511.