1. Introdução
Genes para proteínas transmembrana (TMPs) compõem 20% a 30% da maioria dos genomas (Wallin & Heijne, 1998), e com base em suas funções críticas na célula fisiologia, TMPs são os alvos de uma grande fração de clinicamente útil drogas. Assim, a determinação das suas estruturas e modos de Acção reveste-se de uma importância considerável. No entanto, o número de estruturas TMP de alta resolução disponíveis permanece relativamente baixo (Ver página web de Stephen White; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Duas explicações que são freqüentemente invocados para a dificuldade de obtenção de bem-diffracting cristais de TMPs para uso em raio-X, difração de estudos são: (1) TMPs são estruturalmente dinâmico com flexibilidade de regiões que tornam difícil para a proteína para adotar o uniforme conformação necessária para a embalagem em um cristal; e (2) as superfícies das regiões transmembrana de TMPs não participam tão facilmente como as superfícies de globulares proteínas solúveis em proteína–proteína interações que são necessárias para o cristal de embalagem. A introdução de uma proteína solúvel estável em uma região exposta à superfície de uma TMP fornece uma maneira de potencialmente contornar ambos os problemas, uma vez que tal inserção em um local interno em uma TMP pode reduzir a flexibilidade global e uma vez que a presença de um domínio solúvel facilmente cristalizável pode fornecer contatos intermoleculares necessários para a cristalização (Chun et al., 2012; Engel, Chen, & Privé, 2002).
a fusão da lisozima T4 (T4L) em locais internos em TMPs tem, até à data, proporcionado uma abordagem bem sucedida para a determinação das estruturas de diversos membros da importante superfamília GPCR (Cherezov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Fenalti et al., 2014; Granier et al., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola et al., 2008; Kruse et al., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; White et al., 2012; Wu et al., 2010, 2012; Xu et al., 2011; Zhang et al., 2012). Perfusões internas similares de um apocitocromo B termicamente estabilizado (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014) e rubredoxina (Tan et al., 2013) também produziram estruturas GPCR. Além disso, várias estruturas GPCR foram obtidas por cristalização de construções nas quais o parceiro de proteína estabilizante foi fundido no N-terminal da sequência de receptores, ao invés de em uma posição interna (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thompson et al., 2012; Wu et al., 2014), sugerindo que o papel das proteínas de fusão na facilitação da formação de contatos intermoleculares pode ser mais importante para promover a cristalização do que a redução da flexibilidade da TMP. Abordagens alternativas para a obtenção de estruturas GPCR que não envolvem o uso de proteínas de fusão incluíram cocristalização com anticorpos anti-receptores (Kruse et al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et al., 2013) e a cristalização de variantes GPCR que foram termostabilizadas pela introdução de mutações pontuais e supressões (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). Na verdade, a maioria das variantes GPCR contendo proteínas de fusão usadas para a determinação bem sucedida da estrutura também incorporaram mutações pontuais e truncações projetadas para aumentar ainda mais a estabilidade proteica e reduzir a flexibilidade.
a inserção de proteínas solúveis estáveis em TMPs com o objetivo de promover a cristalização tem sido geralmente realizada como uma inserção ou substituição de resíduos no terceiro ciclo intracelular (IC3) de GPCRs. Isto é baseado na expectativa de que esta região em receptores é flexível e pode controlar o movimento relativo de hélices circundantes (Rosenbaum et al., 2007), bem como reduzir a probabilidade de a inserção do parceiro de fusão perturbar a estrutura global da GPCR (Chun et al., 2012). Embora tais inserções muitas vezes não perturbem as estruturas gerais dos receptores (com base na retenção de pelo menos alguma afinidade ligando ligando pelas construções de fusão), eles geralmente resultam na perda da capacidade de ativar a proteína G trimeric cognato (Rosenbaum et al., 2007), o que não é surpreendente uma vez que o ciclo IC3 é muitas vezes o local de interações funcionais entre GPCRs e as proteínas trimeric G que são seus efetores downstream imediatos. Além disso, os critérios para estabelecer determinados locais de junção para a inserção de proteínas de fusão e para determinar a quantidade de sequência de receptores que substituem não estão bem estabelecidos. Uma fusão bem sucedida deve proporcionar uma combinação óptima entre o espaçamento e a orientação do N – E C-termini da proteína inserida e os locais de junção da GPCR (Chun et al., 2012; Engel et al., 2002). Assim, a criação de uma fusão útil pode exigir síntese ou construção de múltiplas versões de genes fundidos (Rosenbaum et al., 2007).
aqui descrevemos uma estratégia para a geração e triagem de uma biblioteca de formas variantes de um receptor contendo inserções de T4L em diferentes pontos no terceiro intracelular (IC3) loop como um substituto para diferentes números de resíduos de aminoácidos na sequência em loop (Mateus, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Expressando receptores na levedura, é possível criar randomizados bibliotecas de variantes com lisozima inserções e diretamente da tela para construções com o máximo global níveis de expressão, números de ligante sítios de ligação na superfície da célula, e, até mesmo, a função do receptor, analisados com base na ativação do cognato G de proteína. As abordagens foram bem sucedidas na identificação de receptores com inserções no circuito IC3 que retêm quase completa função de sinalização. Isto sugere que, quando ligada através de sequências de ligação apropriadas, a molécula T4L pode ser inserida neste ciclo sem impedir o acesso da proteína G A superfícies relevantes do receptor activado.
os protocolos descritos foram desenvolvidos utilizando Ste2p, um GPCR endógeno da levedura Saccharomyces cerevisiae utilizado como um sistema inicial tratável para o qual ainda não existe estrutura tridimensional disponível. No entanto, abordagens semelhantes podem ser utilizadas para identificar variantes contendo inserção das numerosas GPCRs de mamíferos que têm sido relatadas serem capazes de ativar a via de resposta feromona levedura (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), ou a outros tmp para os quais é possível ensaiar para função em células intactas. Além disso, as espécies de leveduras têm sido utilizadas como Sistemas de expressão para a determinação da estrutura das GPCRs e de outros TMPs (Clark et al., 2010), incluindo para a determinação da estrutura cristalina do receptor humano de histamina H1 (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). O Ste2p é o receptor para o factor α-feromona de acasalamento da levedura, um peptídeo de 13 resíduos. A ligação deste ligando resulta na ativação de uma proteína G heterotrimérica citoplásmica heterotrimérica, que, por sua vez, ativa uma via de cinase do mapa, levando, em última análise, a respostas transcritivas, mudanças na forma celular, paragem do ciclo celular, e fusão com células de levedura do tipo de acasalamento oposto.