Classicamente, para realizar um radioimunoensaio, uma quantidade conhecida de um antígeno é feita radioativo, com freqüência, rotulando-a com gama-isótopos radioativos de iodo, tais como 125-I, anexado a tirosina. Este antigénio marcado radioactivamente é então misturado com uma quantidade conhecida de anticorpos para esse antigénio, e como resultado, os dois ligam-se especificamente um ao outro. Em seguida, é adicionada uma amostra de soro de um doente que contenha uma quantidade desconhecida desse mesmo antigénio. Isto faz com que o antigénio não marcado (ou “frio”) do soro concorra com o antigénio marcado radioactivamente (“quente”) para os locais de ligação de anticorpos. À medida que a concentração do antigénio “frio” aumenta, mais liga-se ao anticorpo, deslocando a variante marcada radioactivamente, e reduzindo a razão entre o antigénio marcado radioactivamente com anticorpos e o antigénio livre marcado radioactivamente. Separam-se então os antigénios ligados e mede-se a radioactividade do antigénio livre(não ligado) remanescente no sobrenadante utilizando um contador gama.
este método pode ser utilizado para qualquer molécula biológica em princípio e não se restringe aos antigénios séricos, nem é necessário utilizar o método indirecto de medição do antigénio livre em vez de medir directamente o antigénio capturado. Por exemplo, se é indesejável ou não possível rotular o antígeno ou molécula alvo de interesse, Uma RIA pode ser feita se dois anticorpos diferentes que reconhecem o alvo estão disponíveis e o alvo é grande o suficiente (por exemplo, uma proteína) para apresentar múltiplos epítopos para os anticorpos. Um anticorpo seria marcado radioactivamente como acima, enquanto o outro permaneceria não modificado. A RIA começaria com o anticorpo sem marcação “fria” sendo permitido interagir e se ligar à molécula alvo em solução. De preferência, este anticorpo não marcado é imobilizado de alguma forma, como acoplado a uma cama de agarose, revestido a uma superfície, etc. Em seguida, o anticorpo marcado radioactivamente “quente” pode interagir com o primeiro complexo molecular de anticorpos-alvo. Após uma lavagem extensa, mede-se a quantidade directa de ligação de anticorpos radioactivos e quantifica-se a quantidade de molécula-alvo, comparando-a com uma quantidade de referência determinada ao mesmo tempo. Este método é, em princípio, semelhante ao método ELISA em sanduíche não radioactivo.