Cromatografie de filtrare cu Gel

cromatografie de filtrare cu Gel Aplicații

cromatografie de filtrare cu Gel, un tip de cromatografie de excludere a dimensiunii, poate fi utilizată fie pentru fracționarea moleculelor și complexelor dintr-o probă în fracții cu un anumit interval de dimensiuni, pentru a elimina toate moleculele mai mari decât o anumită dimensiune din eșantion, fie pentru o combinație a ambelor operații. Cromatografia de filtrare cu Gel poate fi utilizată pentru a separa compuși precum molecule mici, proteine, complexe proteice, polizaharide și acizi nucleici atunci când sunt în soluție apoasă. Atunci când un solvent organic este utilizat ca fază mobilă, procesul este denumit în schimb cromatografie de permeație cu gel.

cromatografia de filtrare cu Gel poate fi utilizată și pentru:

• Fracționarea moleculelor și complexelor într-un interval de dimensiuni predeterminat
• analiza și determinarea dimensiunii
• îndepărtarea proteinelor și complexelor mari
• schimb tampon
• desalinizare
• îndepărtarea moleculelor mici, cum ar fi nucleotidele, primerii, coloranții și contaminanții
• evaluarea purității eșantionului
• separarea radioizotopilor legați de cei nelegați

mediile cromatografice de filtrare cu gel pentru toate utilizările de mai sus sunt disponibile în coloane de curgere gravitațională preambalate, coloane de centrifugare, coloane de joasă presiune și coloane de cromatografie cu presiune medie și rășini îmbuteliate.

mecanism de cromatografie de filtrare cu Gel

într-o coloană de cromatografie de filtrare cu gel, faza staționară este compusă dintr-o matrice poroasă, iar faza mobilă este tamponul care curge între mărgelele matricei. Mărgelele au o gamă de dimensiuni definite a porilor, cunoscută sub numele de gama de fracționare. Moleculele și complexele care sunt prea mari pentru a intra în pori rămân în faza mobilă și se deplasează prin coloană cu fluxul tamponului. Moleculele și complexele mai mici care se pot deplasa în pori intră în faza staționară și se deplasează prin coloana de filtrare a gelului printr-o cale mai lungă prin porii mărgelelor.

orice moleculă sau complex care se află deasupra intervalului de fracționare pentru o anumită coloană de cromatografie cu filtrare cu gel se va deplasa prin coloană mai repede decât orice moleculă care poate intra în faza staționară. Prin urmare, orice constituent din eșantion care este deasupra intervalului de fracționare va Eluta mai întâi (în volumul gol) înainte de orice se află în intervalul de fracționare. Dimensiunea minimă care va rămâne în faza mobilă și nu va intra în faza staționară este cunoscută sub numele de limita de excludere. Bio-Rad oferă medii de cromatografie de filtrare cu gel și coloane cu limite de excludere variind de peste trei ordine de mărime, de la 100 daltoni la 100.000 daltoni (100 kDa).

moleculele și complexele care pot intra în faza staționară vor fi fracționate în funcție de dimensiunile lor. Moleculele mai mici vor migra adânc în pori și vor fi întârziate mai mult decât moleculele mai mari care nu intră atât de ușor în pori și sunt astfel eluate din coloană mai repede. Această diferență în migrarea porilor duce la fracționarea componentelor după mărime cu cea mai mare eluare mai întâi.

în coloanele de cromatografie de filtrare cu gel concepute pentru desalinizare, schimb tampon și îndepărtarea moleculelor mici, cum ar fi nucleotidele, sărurile și compușii mici intră ușor în pori, sunt retardați și migrează mai lent prin coloană decât proteinele mai mari sau acizii nucleici. Prin urmare, componentele de interes din eșantion sunt eluate în avans de săruri, nucleotide etc. Kiturile de curățare a ADN-ului care utilizează acest mecanism conțin adesea coloane de spin de filtrare cu gel.

rezoluția, definită aici ca claritatea limitelor dintre fracțiile de mărime, este determinată de dimensiunea mărgelei și de o serie de alți factori. Dimensiunea mai mică a mărgelei produce, în general, o rezoluție mai mare într-o coloană de cromatografie de filtrare cu gel. Moleculele compacte difuzează prin faza staționară mai repede decât moleculele liniare. Excluderea mărimii, intervalul de fracționare și rata de eluție sunt afectate de compoziția tampon, puterea Ionică și pH. pentru fracționarea amestecurilor complexe de proteine, este posibil să fie necesară determinarea empirică a timpilor de eluție și a limitelor de excludere a mărimii.

medii cromatografice de filtrare cu Gel

un criteriu important pentru mediile cromatografice de filtrare cu gel este că mediile sunt inerte și că nimic din eșantion sau din orice tampon nu se leagă de medii. O altă considerație este tipul de coloană de filtrare cu gel utilizată și dacă este utilizată într-un sistem de cromatografie sub presiune sau coloane de flux gravitațional sau spin. Dacă se utilizează un sistem de cromatografie sub presiune, atât coloana, cât și mediul trebuie să poată tolera presiunea și debitele utilizate.

mediile utilizate în mod obișnuit pentru cromatografia de filtrare cu gel se bazează pe margele de agaroză sau poliacrilamidă, dextroză pentru sisteme gravitaționale sau de joasă presiune și rășini polimerice pentru sisteme de presiune medie. Alegerea mediilor depinde de proprietățile componentelor care trebuie separate și de alți factori experimentali. Următoarele sunt considerații generale atunci când se determină alegerea mediilor cromatografice de filtrare a gelului:

• gama de fracționare
• limita de excludere a dimensiunii
• presiunea de funcționare
• debitul
• vâscozitatea eșantionului
• gama pH
• Autoclavabilitate
• toleranță pentru miscibil în apă solvenți organici; unele probe pot fi mai solubile într-un amestec apă-organic
• toleranță pentru detergenți, agenți chaotropici, formamidă etc.
• temperatura de funcționare

tipurile de probe, alegerea mediilor și configurarea sistemului de cromatografie vor determina care parametri sunt cei mai importanți pentru o anumită aplicație de purificare.