2-D electroforeza începe cu electroforeza în prima dimensiune și apoi separă moleculele perpendicular de prima pentru a crea o electroferogramă în a doua dimensiune. În electroforeza din prima dimensiune, moleculele sunt separate liniar în funcție de punctul lor izoelectric. În a doua dimensiune, moleculele sunt apoi separate la 90 de grade de prima electroferogramă în funcție de masa moleculară. Deoarece este puțin probabil ca două molecule să fie similare în două proprietăți distincte, moleculele sunt separate mai eficient în electroforeza 2-D decât în electroforeza 1-D.
cele două dimensiuni în care proteinele sunt separate folosind această tehnică pot fi punctul izoelectric, masa complexului proteic în starea nativă sau masa proteică.
separarea proteinelor prin punctul izoelectric se numește focalizare izoelectrică (IEF). Astfel, un gradient de pH este aplicat unui gel și un potențial electric este aplicat peste gel, făcând un capăt mai pozitiv decât celălalt. La toate valorile pH-ului, altele decât punctul lor izoelectric, proteinele vor fi încărcate. Dacă sunt încărcate pozitiv, vor fi trase spre capătul mai negativ al gelului și dacă sunt încărcate negativ, vor fi trase la capătul mai pozitiv al gelului. Proteinele aplicate în prima dimensiune se vor deplasa de-a lungul gelului și se vor acumula în punctul lor izoelectric; adică punctul în care sarcina totală a proteinei este 0 (o sarcină neutră).
pentru analiza funcționării proteinelor într-o celulă, cunoașterea cooperării lor este esențială. Cel mai adesea proteinele acționează împreună în complexe pentru a fi pe deplin funcționale. Analiza acestei suborganisme a celulei necesită tehnici de conservare a stării native a complexelor proteice. În electroforeza pe gel de poliacrilamidă nativă (pagina nativă), proteinele rămân în starea lor nativă și sunt separate în câmpul electric în urma masei lor și, respectiv, a masei complexelor lor. Pentru a obține o separare în funcție de dimensiune și nu de sarcina netă, ca în IEF, o taxă suplimentară este transferată proteinelor prin utilizarea Coomassie Brilliant Blue sau litiu dodecil sulfat. După finalizarea primei dimensiuni, complexele sunt distruse prin aplicarea paginii SDS de denaturare în a doua dimensiune, unde proteinele din care sunt compuse complexele sunt separate prin masa lor.
înainte de separarea proteinelor în masă, acestea sunt tratate cu dodecil sulfat de sodiu (SDS) împreună cu alți reactivi (SDS-PAGE în 1-D). Aceasta denaturează proteinele (adică le desfășoară în molecule lungi și drepte) și leagă un număr de molecule SDS aproximativ proporționale cu lungimea proteinei. Deoarece lungimea unei proteine (atunci când este desfăcută) este aproximativ proporțională cu masa sa, acest lucru este echivalent cu a spune că atașează un număr de molecule SDS aproximativ proporțional cu masa proteinei. Deoarece moleculele SDS sunt încărcate negativ, rezultatul este că toate proteinele vor avea aproximativ același raport masă-încărcare ca și celelalte. În plus, proteinele nu vor migra atunci când nu au sarcină (rezultat al etapei de focalizare izoelectrică), prin urmare, acoperirea proteinei în SDS (încărcată negativ) permite migrarea proteinelor în a doua dimensiune (pagina SDS, nu este compatibilă pentru utilizarea în prima dimensiune, deoarece este încărcată și trebuie utilizat un detergent neionic sau zwitterionic).în a doua dimensiune, se aplică din nou un potențial electric, dar la un unghi de 90 de grade față de primul câmp. Proteinele vor fi atrase de partea mai pozitivă a gelului (deoarece SDS este încărcat negativ) proporțional cu raportul lor masă-încărcare. După cum sa explicat anterior, acest raport va fi aproape același pentru toate proteinele. Progresul proteinelor va fi încetinit de forțele de frecare. Prin urmare, gelul acționează ca o sită moleculară atunci când se aplică curentul, separând proteinele pe baza greutății lor moleculare, proteinele mai mari fiind reținute mai sus în gel și proteinele mai mici fiind capabile să treacă prin sită și să ajungă la regiunile inferioare ale gelului.