exacerbarea toxicității substratului prin IPTG în Escherichia coli BL21(de3) care transportă o cale metabolică sintetică

biotransformarea TCP prin celule E. coli BL21(de3) în repaus care transportă variante ale unei căi de degradare sintetică

variante ale căii sintetice care prezintă fie haloalkan DEHALOGENAZĂ sau mutantul dhaa31 mutant de 26 de ori mai eficient din punct de vedere catalitic au fost introduse în E. coli Bl21(de3) . Această gazdă a fost selectată deoarece nici enzimele, nici metaboliții căii TCP nu apar în mod natural în rețeaua sa metabolică și din cauza repertoriului larg de vectori Duet disponibili comercial pentru această tulpină, care permit coexprimarea acordabilă a mai multor gene într-o singură celulă . Acest lucru a dus la construirea unui sistem flexibil cu risc limitat de vorbire încrucișată metabolică, în care expresia celor trei componente ale căii ar putea fi manipulată ortogonal . Trei construite anterior E. au fost testați degradanții coli BL21(de3) desemnați degWT, deg31 și deg31opt (Tabelul 1). E. coli degWT poartă o variantă a căii TCP bazată pe DhaA de tip sălbatic împreună cu Hhec și EchA, exprimată într-un raport relativ de 0,24:0,36:0,40, respectiv, determinat după preinducție cu 0,2 mm IPTG (fișier suplimentar 1: Fig. S1). Tulpinile deg31 și deg31opt poartă ambele calea TCP cu dehalogenaza DhaA31 proiectată, dar raportul relativ al celor trei enzime din deg31 este de 0,14:0,41:0,45, în timp ce în deg31opt este de 0,63:0,16:0,21. Experimentele de electroforeză în gel de dodecil sulfat de sodiu poliacrilamidă (SDS-PAGE) au indicat că cele trei enzime de cale au reprezentat împreună o proporție similară din fracțiunea totală de proteine solubile produsă de toți cei trei degradatori: 52% pentru degWT, 54% pentru deg31 și 44% pentru deg31opt.

Pre-indusă (0.2 mm IPTG) celulele de repaus ale fiecăreia dintre tulpinile recombinante și un control gazdă (Tabelul 1) au fost incubate în tampon fosfat cu TCP de 2 mM și s-au înregistrat cursurile de timp ale biotransformării TCP pe un interval de 5 ore (Fig. 1). Profilurile de reacție au evidențiat diferențe fundamentale între tulpini în ceea ce privește ratele inițiale de dehalogenare TCP, acumularea de intermediari și eficiența generală a formării glicerolului. Concentrațiile teoretice de glicerol, altfel utilizate rapid de E. coli, ar putea fi calculată din concentrațiile experimentale ale TCP și intermediarii detectați în virtutea naturii ortogonale a căii . În timp ce deg31opt a beneficiat de cel mai rapid prim pas (Fig. 1d), calea cea mai echilibrată cu cea mai mare producție de glicerol a fost deg31 (Fig. 1c). Pe de altă parte, degWT a suferit o conversie TCP lentă (Fig. 1b), expunerea prelungită la substratul toxic și ieșirea insuficientă a căii. Așa cum era de așteptat, controlul gazdă (care transportă plasmidele goale corespunzătoare, Fig. 1a) a arătat nici o activitate față de TCP în sistemul de lot închis.

cele trei E. recombinanții coli și tulpina martor lipsită de calea sintetică reprezintă un sistem model adecvat pentru studierea contribuției sarcinii metabolice și a toxicității substratului/metabolitului la costul de fitness al biotransformării TCP de către catalizatorii cu celule întregi.

evaluarea sarcinii metabolice și a efectelor toxicității substratului prin placare

viabilitatea celulară, estimată prin placare, este un parametru fiziologic cheie care ar trebui să reflecte capacitatea tulpinilor individuale de a face față solicitărilor cauzate de sarcina metabolică și expunerea la TCP . E. coli degradante pre-induse cu 0.Comenzile IPTG și gazdă de 2 mM au fost placate înainte și după 5 ore de incubare în tampon fosfat cu sau fără TCP de 2 mM. Procentul de celule supraviețuitoare a fost calculat după incubare.

datele obținute din placare înainte de incubare (Fig. 2a) ilustrează efectele separate ale elementelor individuale ale sarcinii metabolice globale impuse celulelor. Mai mulți factori, inclusiv prezența ADN-ului plasmidic și a markerilor de selecție asociați, adăugarea de IPTG și sarcina datorată expresiei căii heterologe au afectat viabilitatea degradanților în paralel chiar înainte de adăugarea substratului toxic. Impactul cel mai pronunțat în această etapă s-a datorat menținerii plasmidelor și expresiei constitutive asociate a genelor marker de selecție din vectorii Duet, precum și prezenței IPTG. Prezența a două plasmide de copiere mediu-mare pCDF (20-40 copii pe celulă) și pETDuet (~40 copii pe celulă) a redus viabilitatea cu 50% (P < 0,01; Fig. 2a). „Preinducția” controlului gazdă cu plasmide goale a redus viabilitatea cu aproape 40% față de controlul neindus (P < 0,01). Expresia enzimelor de cale în degradanții E. coli a redus și mai mult viabilitatea cu aproximativ 20 % (P < 0,05). Reducerea suplimentară a viabilității deg31opt în comparație cu degWT și deg31 poate fi atribuită diferenței markerilor de selecție a antibioticelor între trei recombinanți.

datele colectate după incubarea 5 h cu sau fără TCP (Fig. 2B și fișier suplimentar 1: Fig. S2) a inclus mai multe observații neașteptate. În mod surprinzător, TCP (adăugat inițial la o concentrație de 2 mM) a avut doar efecte minore sau neglijabile asupra viabilității celulelor de control neinduse care poartă plasmide goale; nu a existat nicio diferență semnificativă de viabilitate între aceste celule și controalele gazdă care nu au fost expuse nici TCP, nici IPTG. Acest lucru a fost neașteptat, deoarece s-a raportat că TCP inhibă puternic celulele în creștere ale E. coli BL21(DE3) și gazdele naturale, cum ar fi A. radiobacter AD1 sau Pseudomonas putida MC4, chiar și la concentrații cu 50% mai mici decât cele utilizate aici . Pe de altă parte, efectul dăunător al IPTG a fost semnificativ statistic (P < 0,01) (Fig. 2B și fișier suplimentar 1: Fig. S2). Cea mai izbitoare observație a fost că viabilitatea relativă a celulelor preinduse cu IPTG și apoi expuse la TCP a fost cu aproape 90% mai mică decât cea a controalelor gazdă expuse la niciuna dintre substanțe (P < 0,01) (Fig. 2b). Această pierdere dramatică a viabilității nu corespunde unei simple sume a efectelor individuale ale celor doi compuși; este evident că IPTG a exacerbat toxicitatea TCP. Faptul că IPTG a exacerbat toxicitatea TCP și nu invers a fost confirmat prin placarea a trei recombinanți care poartă calea de biodegradare sintetică (Fig. 2b). Deoarece acești degradatori aveau căi funcționale pentru degradarea TCP, ei au fost mai capabili să-i tolereze prezența. Important, cu cât conversia TCP de către enzimele căii este mai rapidă, cu atât viabilitatea degradanților este mai mare. Deg31opt, care a obținut o conversie inițială rapidă a TCP, dar a acumulat cantități semnificative de intermediari DCP și GDL, a supraviețuit incubației 5 h aproape la fel de bine ca și controlul gazdă care nu a fost expus la substrat. Aceste date sunt în concordanță cu rezultatele raportate anterior ale testelor de stopare a creșterii, care au indicat că TCP este cel mai toxic compus din cale .

evaluarea sarcinii metabolice și a efectelor toxicității substratului prin citometrie în flux multi-parametru

citometrie în flux Multi-parametru permite determinarea simultană a mai multor variabile biochimice și fizice imediat după prepararea probei și, prin urmare, ar trebui să furnizeze informații mai precise despre starea fiziologică a celulelor decât pot fi obținute prin placare . Această tehnică oferă, de asemenea, informații cheie despre eterogenitatea populațiilor bacteriene. Spre deosebire de placare, nu subestimează numărul de celule viabile din culturile originale în cazurile în care o fracțiune din populație a suferit leziuni subletale și a pierdut capacitatea de a crește .

incubarea celor trei degradatori și controale gazdă a fost efectuată în condițiile menționate în secțiunea anterioară. Probele prelevate după 5 ore de incubare cu sau fără TCP au fost colorate cu iodură de propidiu (PI), 6-carboxi-2′,7′-diclordihidrofluoresceină diacetat (carboxi-H2DCFDA) sau bis-(acid 1,3-dibutilbarbituric) trimetină oxonol . Coloranții pentru etichetarea acizilor nucleici, cum ar fi PI, care intră numai în celule cu membrane compromise, sunt utilizați în mod obișnuit cu coloranți sensibili la potențialul membranei, cum ar fi DiBAC4(3), care leagă componentele intracelulare care conțin lipide, pentru a studia viabilitatea bacteriană . Carboxi-H2DCFDA este o formă de fluoresceină redusă chimic, acetilată și carboxilată, care a găsit multe aplicații ca indicator general pentru prezența speciilor reactive de oxigen (ROS) în celulele eucariote și procariote . Studii recente privind utilizarea bacteriană a hidrocarburilor alifatice clorurate sugerează că acest proces este asociat cu stres oxidativ puternic și am emis ipoteza că TCP ar evoca și un astfel de răspuns fiziologic . Saturarea acizilor grași nesaturați prin halogenare sau peroxidare lipidică determină modificări ale fluidității membranei, ducând la prăbușirea lanțurilor de transport de electroni și transferul prematur de electroni în oxigen, însoțit de formarea ROS, permeabilizarea membranei și moartea celulelor .

protocolul de citometrie în flux la punctul final adoptat în studiul nostru a fost mai puțin sensibil decât placarea în demonstrarea sarcinii cauzate de plasmide (Fig. 2b), posibil deoarece prezența ADN-ului heterolog și expresia constitutivă a markerilor de selecție nu au modificat direct proprietățile vizate de citometrie, ci au dezechilibrat starea energetică generală a celulelor. Cu toate acestea, abordarea citometriei în flux utilizând fluorocromi selectați a fost utilă în expunerea efectelor toxice ale IPTG și TCP. Nu au existat diferențe semnificative (P > 0.05) între controalele gazdă neinduse cu plasmide goale, indiferent de starea lor de expunere TCP, cu privire la oricare dintre cele trei variabile examinate în aceste experimente (permeabilitatea membranei, formarea ROS și potențialul membranei; vezi Fig. 2b). Cu toate acestea, proporția de celule colorante pozitive pentru DiBAC4(3) a crescut de până la trei ori în grupul de control tratat numai cu IPTG (P < 0, 01). Același efect a fost observat și în deg31, al cărui răspuns la inducție și incubare cu TCP a fost studiat mai detaliat (Fig. 3). Fracțiunea populației bacteriene care colorează pozitiv cu toți cei trei coloranți a crescut de mai multe ori atunci când tratamentul prealabil cu IPTG a fost combinat cu expunerea TCP, confirmând efectul exacerbant observat anterior și indicând faptul că acțiunea TCP în celulele bacteriene este însoțită de formarea extinsă a ROS (Fig. 2b, 3). Depolarizarea membranei, acumularea ROS și permeabilitatea membranei au fost reduse în recombinanții E. coli care exprimă calea de biodegradare sintetică, gradul de reducere fiind proporțional cu ratele inițiale de conversie TCP ale tulpinilor. Interesant este că exacerbarea toxicității compusului prin preinducția controlului gazdei BL21 (de3) cu IPTG a fost confirmată și în experimente folosind modelul compusului toxic terț-butil hidroperoxid (TBHP), un peroxid organic și formarea puternică a ROS care promovează agentul oxidativ (fișier suplimentar 1: Fig. S3). Acest lucru sugerează că fenomenul de exacerbare descris nu trebuie limitat doar la modelul nostru TCP chimic toxic.

depolarizarea membranei și formarea ROS in vivo sunt procese dinamice. Pentru a urmări cinetica lor în degradatorii de E. coli am efectuat și măsurători cu rezolvare în timp (fișier suplimentar 1: Fig. S4). Numărul de celule colorate de DiBAC4 (3) și carboxi-H2DCFDA a crescut liniar în timp la toți recombinanții stresați, cu excepția deg31. Interesant este că acest degradator a prezentat o explozie inițială de fluorescență DiBAC4 (3) și carboxi-H2DCFDA, dar aceste semnale au scăzut sau au scăzut ușor. Presupunem că profilurile caracteristice ale fluorescenței DiBAC4 (3) și carboxi-H2DCFDA pentru deg31 sunt legate de varianta sa unică a căii de biodegradare sintetică și de cursul de timp corespunzător al biotransformării TCP. Spre deosebire de celelalte tulpini, TCP, 2,3-dicloropropan-1-ol (DCP) și glicidol (GDL) au fost prezente la concentrații relativ mari în amestecul de reacție deg31 între minutele 50 și 100 ale perioadei de măsurare. Acest lucru poate fi cauzat toxicitate sinergică, crescând numărul de celule cu membrane depolarizate și formarea crescută a ROS. Astfel de efecte comune sunt frecvente; au fost observate pentru pesticidele organofosfatice, fluorosurfactanții și metalele grele, printre altele . Înghețarea ulterioară sau scăderea moderată a intensității semnalelor a fost atribuită îndepărtării paralele a TCP și GDL și producției de glicerol, care este cunoscut a fi un protector eficient de stres în drojdie și tulpini tolerante la solvent de E. coli .

varianta căii sintetice prezente în deg31 părea să ofere cel mai bun compromis în ceea ce privește combaterea toxicității, transformând în mod eficient TCP în glicerol inofensiv și, prin urmare, a fost selectată pentru investigații suplimentare.

evaluarea sarcinii metabolice și a efectelor toxicității substratului prin microscopie electronică

sarcina metabolică și toxicitatea pot determina modificări ale morfologiei gazdelor bacteriene . Prin urmare, am utilizat microscopia electronică de transmisie pentru a studia modificările morfologiei celulelor deg31 induse și neinduse după incubarea 5 h cu sau fără TCP de 2 mM (Fig. 3). Imagini ale celulelor de control gazdă E. coli induse și neinduse cu plasmide goale sunt prezentate în (fișier suplimentar 1: Fig. S5). Observațiile microscopice au fost urmate de citometria în flux multi-parametru a celulelor deg31 colorate cu PI, carboxi-H2DCFDA sau DiBAC4(3).

incubarea degradanților neinduși cu TCP a produs doar o mică proporție de celule bacteriene moarte, iar morfologia celulelor tratate în acest mod nu a diferit în general de cea a celulelor neexpuse la substratul toxic (Fig. 3a, b). Proporția celulelor colorate de carboxi-H2DCFDA și PI a crescut moderat, dar nu a fost observat niciun efect asupra potențialului membranei. Bacteriile preinduse care produc proteine recombinante au format intens corpuri de incluziune vizibile și au arătat separarea frecventă a membranei citoplasmatice de membrana exterioară la polii celulei (Fig. 3c). Deoarece majoritatea proteinelor recombinante obținute din lizați celulari au fost solubile (datele nu au fost prezentate), considerăm că organismele observate au constat din enzime active.

combinația de preinducție și incubare cu TCP a produs cele mai pronunțate modificări morfologice și a fost însoțită de creșteri substanțiale ale numărului de celule colorând pozitiv pentru PI, carboxi-H2DCFDA și DiBAC4(3) (Fig. 3d). Numeroase celule moarte sau moarte cu membrane citoplasmatice deteriorate și conținut scurs au fost clar vizibile. Chiar și așa, o parte semnificativă a populației a rezistat efectelor combinate ale IPTG și TCP în perioada de tratament de 5 ore. Acest lucru s-a datorat în principal căii sintetice bine echilibrate a deg31 și conversiei sale rapide a TCP în glicerol. Bistabilitatea este un fenomen comun și poate fi atribuită zgomotului în expresia trăsăturilor multigenice responsabile de toleranța la toxicitate și răspunsul la stres gradat la populația bacteriană . În rezumat, observațiile noastre microscopice ale populațiilor deg31 tratate în patru condiții diferite au fost în concordanță cu rezultatele anterioare și au susținut concluzia că preinducția cu IPTG exacerbează toxicitatea TCP.

efectul de exacerbare a toxicității crește în celulele care se confruntă cu sarcina metabolică din plasmide

având în vedere că atât degradanții E. coli, cât și controalele gazdă utilizate în această lucrare au trebuit să facă față sarcinii metabolice a plasmidelor Duet și a sistemului de Expresie LacIQ/P lacUV5-T7, am decis să includem controalele E. coli fără aceste componente în experimentul următor. În acest scop, am folosit E. coli BL21(DE3) fără plasmide și tulpina de clonare E. coli DH5a, care nu are atât sistemul de Expresie LacIQ/p lacUV5-T7, cât și operonul lac. Prin utilizarea protocoalelor de placare și citometrie în flux descrise mai sus, am constatat că efectul de exacerbare a fost modest sau complet absent la ambele tulpini (fișier suplimentar 1: Fig. S6A, B). Acest lucru sugerează că stresul dublu din IPTG și TCP se manifestă numai în tulpini care transportă plasmide Duet și sistemul de Expresie corespunzător.

presupunem că recombinanții studiați nu au putut suprima eficient stresul dublu din IPTG și substratul toxic din cauza sarcinii metabolice impuse de plasmide și a lipsei corespunzătoare de resurse necesare pentru întreținerea celulelor. Se pare că structura chimică a IPTG, transportul sau prezența sa în interiorul celulei declanșează modificări fiziologice care facilitează manifestarea toxicității TCP în celulele E. coli BL21(DE3) cu plasmide Duet.

reducerea sarcinii metabolice și exacerbarea toxicității prin reglarea concentrației de IPTG

în continuare, am încercat să reducem povara impusă recombinanților E. coli prin optimizarea concentrației de IPTG. Am căutat cea mai mică concentrație posibilă de inductor care să reducă la minimum costul de fitness fără a compromite în mod semnificativ eficiența sistemului la degradarea TCP. Celulele Deg31 au fost preinduse cu concentrații de IPTG cuprinse între 0,01 și 1,00 mM și au fost studiate efectele rezultate asupra viabilității celulare și eficienței căii (Fig. 4; fișier suplimentar 1: Fig. S7).

E. coli BL21(de3) cu plasmidele goale pETDuet și pCDF a fost utilizat ca un control pentru placare pentru a evalua sarcina impusă gazdei prin expunerea la IPTG în absența căii heterologe (Fig. 4). Viabilitatea degradatorului și controlului preinduse a fost verificată înainte și după 5 ore de incubare în tampon fosfat cu TCP de 2 mM și comparată cu cea a celulelor care nu sunt expuse la IPTG (Fig. 4a, b). Procentul de celule supraviețuitoare după incubare a fost calculat în fiecare caz (Fig. 4c). Aceste experimente au indicat că, chiar și în absența TCP, a existat o corelație inversă între concentrația IPTG și viabilitatea E. coli recombinant (Fig. 4a). Tulpina deg31 a suferit mai mult de creșterea concentrațiilor de IPTG decât de control, probabil datorită sarcinii suplimentare de exprimare a genelor care codifică calea sintetică. Opusul a fost adevărat după 5 ore de incubare, deoarece tulpina deg31 CATABOLIZANTĂ TCP a fost mai rezistentă la toxicitatea exacerbată decât controlul gazdei (Fig. 4b, c). Tulpina de cale sintetică a prezentat rate de supraviețuire similare la toate concentrațiile de IPTG testate, cu excepția celor mai mari—viabilitatea relativă a deg31 preindusă cu IPTG de 1 mM a fost de 100 %. Am presupus că această valoare periferică s-a datorat subestimării numărului de celule viabile înainte de incubare din cauza stresului intens experimentat de degradator la inducerea cu o concentrație atât de mare de IPTG și a prezenței rezultate a celulelor viabile, dar nu culturabile în suspensie . Experimentele de placare au demonstrat că o fracțiune din populația bacteriană și-a recăpătat capacitatea de a crește și de a se reproduce la ceva timp după tratament cu această concentrație mare de IPTG (fișier suplimentar 1: Fig. S8).

cursurile de timp ale biotransformării TCP cu celule de repaus de deg31 preinduse cu IPTG la 1,00, 0,20, 0,05, 0,025 și 0,01 mM (fișier suplimentar 1: Fig. S7) și analiza densitometrică a gelurilor de poliacrilamidă SDS cu probele corespunzătoare de extracte fără celule (fișier suplimentar 1: Fig. S9, tabelul S1) a arătat că: (i) raportul relativ al enzimelor căii și forma profilului de degradare nu s-au modificat substanțial cu concentrația inductorului, în timp ce (ii) conținutul celor trei enzime căii în proteina solubilă totală a bacteriilor recombinante a scăzut de la 55 % (1 mm IPTG) la 32 % (0,01 mm IPTG), iar producția căii a scăzut de la 70 la 46 %. Conversia apreciabilă a TCP a fost realizată și cu celule neinduse datorită scurgerii promotorului T7 și a expresiei bazale a genelor în cadrul căii (fișier suplimentar 1: Fig. S7).

Figura 5 rezumă echilibrul celor trei parametri discutați în secțiunile precedente: (i) viabilitatea gazdei, (ii) expresia celulară a enzimelor căii și (iii) producția căii de biodegradare sintetică. Concluzionăm că concentrația minimă de IPTG care permite exprimarea suficientă a genelor în cadrul căii pentru a obține o ieșire rezonabilă este de 0,025 mM. concentrații similare de inductor care permit exprimarea completă a genei au fost raportate pentru proteinele recombinante unice, cum ar fi galactozidaza, proteina fluorescentă verde și aldolaza de ramnuloză-1-fosfat . Rețineți că concentrația de IPTG de 0,025 mM este de opt ori mai mică decât concentrația inductorului testat inițial și de până la 40 de ori mai mică decât valorile raportate în literatura științifică care descrie ingineria căilor heterologe în E. coli . Inducția cu cantități mai mici de IPTG a îmbunătățit starea de fitness a gazdei. Cu toate acestea, chiar și cea mai mică concentrație de 0,01 mM a redus viabilitatea degradatorului E. coli cu 30% față de deg31 neindus și cu până la 50% față de controlul gazdei neindus (P < 0,05 în ambele cazuri; Fig. 4b). Prin urmare, am investigat domeniul de aplicare pentru înlocuirea IPTG cu un inductor alternativ.

reducerea sarcinii metabolice și exacerbarea toxicității prin inducerea cu lactoză

lactoza este un inductor natural al operonului lac și poate fi utilizată ca o alternativă mai ieftină la IPTG sintetic. S-a dovedit că induce expresia proteinelor recombinante în E. coli în aceeași măsură ca IPTG atât la scară de laborator, cât și la scară industrială . Spre deosebire de IPTG, lactoza este un substrat al lacto-galactozidazei (codificată de lacZ) și astfel poate fi metabolizată de celule cu un operon lac intact, inclusiv E. coli BL21(de3). Prin urmare, concentrațiile de lactoză de până la 30 mM sunt utilizate în mod obișnuit pentru a induce expresia genelor clonate la niveluri care pot fi atinse cu IPTG de 1 mm .

am investigat preinducția celulelor deg31 cu lactoză de 1 mM. Am presupus că această concentrație ar fi suficientă pentru a induce expresia genelor căii de degradare TCP la niveluri care ar conferi o eficiență adecvată a degradării. Această așteptare a fost confirmată de cursurile de timp înregistrate de biotransformare TCP și de constatarea că enzimele căii au reprezentat până la 41% din proteina solubilă totală a celulelor în aceste condiții (fișier suplimentar 1: fig. S7 și S9 și tabelul S1). Conversia teoretică a TCP în glicerol în aceste condiții a fost de 63 %. Aceste valori sunt apropiate de cele observate pentru celulele deg31 preinduse cu 0,025 sau 0,05 mm IPTG. Cel mai important, celulele deg31 preinduse cu lactoză au prezentat o viabilitate mai mare înainte și după incubarea 5 h cu TCP comparativ cu bacteriile tratate cu IPTG la oricare dintre concentrațiile testate (P < 0,05; Fig. 4). Același efect de ameliorare a fost observat pentru controlul gazdei. În ceea ce privește supraviețuirea, celulele preinduse cu lactoză s-au comportat aproape la fel de bine ca și omologii lor neinduși (Fig. 4c). În conformitate cu rezultatele placării, analiza citometrică în flux a celulelor gazdă control și deg31 preinduse cu lactoză a evidențiat niveluri semnificativ mai scăzute de celule stresate cu membrane depolarizate decât au fost observate pentru tulpinile de E. coli preinduse cu IPTG (P < 0,01; fișier suplimentar 1: Fig. S10). Aceste rezultate au indicat din nou că acțiunea IPTG în recombinanții studiați a fost însoțită în mod constant de modificări ale proprietăților membranei.

o viabilitate mai mare a celulelor induse cu lactoză în loc de IPTG a fost raportată anterior pentru exprimarea proteinelor heterologe unice . Acest efect a fost atribuit inducției întârziate și mai ușoare realizate cu inductorul natural. Spre deosebire de IPTG sintetic, care poate intra rapid în celulă atât prin difuzie pasivă, cât și cu ajutorul Permeazei lactozei dantelate, lactoza poate intra în citoplasmă doar prin permează. Mai mult, lactoza trebuie convertită în alolactoză de către galactozidază înainte de a se lega de represorul lac, în timp ce IPTG se leagă direct de represor. Rezultatele noastre confirmă faptul că lactoza impune o povară metabolică mai mică decât IPTG, sugerând că este, de asemenea, un inductor mai potrivit pentru exprimarea căilor heterologe întregi în E. coli BL21(de3). Acest lucru este deosebit de important pentru celulele E. coli BL21(DE3) care transportă căi sintetice care degradează compușii toxici sau produc intermediari toxici.