rezultate și discuții
analiza PCR-RFLP a evidențiat modele de restricție compatibile cu analiza in silico. Toți câinii cu malformații ale cozii au prezentat același model (3 fragmente, 2 benzi vizibile), care a fost diferit de cel prezentat de câinii cu coadă normală (2 fragmente, 1 bandă vizibilă) (Fig.1). Un alt test, bazat și pe PCR-RFLP, a fost utilizat cu succes pentru a identifica aceeași mutație în gena T a câinilor, dar folosind un sistem de electroforeză pe gel de poliacrilamidă (Gruszczynska & Czapla 2011). Performanța electroforezei pe gel de poliacrilamidă ar putea îmbunătăți rezoluția benzilor în raport cu fragmentele de ADN în studiul de față. Cu toate acestea, practicitatea ar fi redusă, deoarece acest sistem este mai laborios. În studiul de față, chiar dacă nu a fost posibilă vizualizarea tuturor fragmentelor de ADN generate după digestie, a fost posibilă distingerea cu ușurință a genotipurilor folosind electroforeza cu gel de agaroză.
Fig.1. PCR – RFLP pentru detectarea mutației C189G. Marker de perechi de baze (M), câini afectați – coadă scurtă (1-7) și animal cu coadă normală (8).
în analiza probelor secvențiate, heterozigozitatea C (citozină) G (guanină) a fost observată în nucleotida 189 a exonului 1 numai la câinii cu malformații ale cozii. Localizarea mutației s-a bazat pe secvența ARNm a genei T disponibilă în Genbank (număr de aderare: AJ245513).
la analiza in silico, s-a observat, de asemenea, alterarea aminoacidului 63 de la izoleucină la metionină. Toate secvențele ADN obținute în studiul de față au fost depozitate în Genbank sub numerele de acces: MF495488 (coada scurtă), MF495489 (absența cozii), MF495490 (absența cozii) și MF495491 (coada normală).
deși s-a găsit un singur genotip pentru starea actuală (CG pentru animalele cu malformații ale cozii), s-a observat o variație fenotipică la câinii afectați, care este dimensiunea cozii. Unele animale au prezentat coadă scurtă (aproximativ 3-4 vertebre), iar altele au prezentat absența cozii (aproximativ 1-2 vertebre) (Fig.2). Fenotipuri similare au fost observate și de Haworth și colab. (2001) la câini. Deși o explicație pentru acest lucru nu este încă cunoscută la câini, Buckingham și colab. (2013), studiind variația congenitală a mărimii cozii la pisici, a găsit dovezi ale haploinsuficienței cauzate de mutații multiple în gena T. Mutațiile C. 1199delc, c.1169delc și C.998delT au fost asociate cu diferite niveluri de exprimare a genelor, ceea ce ar putea explica diferitele fenotipuri în rândul câinilor cu malformații ale cozii (Buckingham și colab. 2013).
Fig.2. (A) câine care poartă mutația C189G în gena T. (B) câine din aceeași așternut fără mutație C189G.
caracterul ereditar al mutației poate fi evidențiat prin analiza heredogramei (Fig.3) din așternutul studiat. A fost posibil să se verifice dacă mutația are un model de moștenire autosomal dominant. Cu toate acestea, în studiul de față nu a fost găsit niciun genotip homozigot dominant (GG), consolidând observațiile că, atunci când se află în homozigoză, gena t mutantă provoacă moartea fetală (Haworth și colab. 2001). Hytonen și colab. (2009) a observat că puii de la încrucișări între animale cu coadă normală (genotipul CC) au fost cu 29% mai mari decât puii de la încrucișări între animale cu coadă malformate (genotipul CG). Acest rezultat este compatibil cu reducerea preconizată de 25% a descendenților din încrucișări care implică alele letale.
Fig.3. Heredograma care prezintă modelul de moștenire al mutației C189G în gena T A Labrador Retriever. Încrucișarea între bunicii materni (I), așternutul câinelui afectat și încrucișarea acestuia cu masculul normal (II) și așternutul analizat (III).
mutațiile genei T au fost asociate cu malformații ale cozii la alte specii, cum ar fi șoarecii și pisicile (Wilson și colab. 1995, Buckingham și colab. 2013). Și în unele dintre ele, se observă și alte modificări, cum ar fi incontinența urinară și fecală la pisici (Robinson 1993). Cu toate acestea, la câini, până în prezent, s-au observat doar malformații ale cozii la animalele heterozigote (CG) (Indrebo și colab. 2008). Deși la unele rase canine fenotipul „malformației cozii” nu a fost asociat cu mutația C189G (Boston Terrier, Bulldog Englez, King Charles Spaniel, Schnauzer miniatural, Parson Russell Terrier și Rottweiler), numărul mare de rase afectate sugerează o mutație antică (Hytonen și colab. 2009), fiind prezent la câinii ancestrali înainte de formarea multor rase. Cu toate acestea, încrucișarea interrasială ar fi putut contribui, de asemenea, la difuzia mutației, deoarece animalele heterozigote CG par să nu aibă libidou sau modificări ale performanței reproductive. Un alt factor care ar fi putut contribui la difuzia mutațiilor a fost utilizarea în reproducerea câinilor fără coadă, când caudectomia estetică era încă permisă. În această perioadă, este probabil ca multe animale cu ageneză de coadă să fi fost folosite ca reproducători, deoarece absența cozii a fost de dorit la unele rase, contribuind la difuzia mutației.
în prezent, practica caudectomiei (îndepărtarea chirurgicală a cozii) este o procedură interzisă în mai multe țări ale lumii, cum ar fi cele din Uniunea Europeană și Brazilia (Haworth și colab. 2001, CFMV 2013). În unele țări ale Uniunii Europene, testele genetice pentru identificarea mutației C189G în gena T sunt utilizate pentru a verifica dacă absența cozii la unele rase este de origine congenitală sau animalele au suferit o procedură chirurgicală neregulată. PCR-RFLP utilizat în studiul de față a fost o tehnică simplă și precisă pentru identificarea acestei mutații și ar putea fi utilizată ca dovadă pentru identificarea practicii ilegale de caudectomie.
din cauza lipsei de informații despre mutația C189G în gena T a câinilor, nu există informații suplimentare cu privire la asocierea sa cu alte caractere morfologice sau chiar fiziologice și, prin urmare, trebuie investigate.