un cod genetic similar este folosit de majoritatea organismelor de pe Pământ, dar diferite organisme au preferințe diferite pentru codonii pe care îi folosesc pentru a codifica aminoacizi specifici. Acest lucru este posibil deoarece există 4 baze (A, T, C și G) și 3 poziții în fiecare codon. Prin urmare, există 64 de codoni posibili, dar numai 20 de aminoacizi și 3 codoni de oprire pentru a codifica, lăsând 41 de codoni neînregistrați. Rezultatul este redundanța; mai mulți codoni codifică aminoacizi unici. Constrângerile evolutive au modelat ce codoni sunt folosiți preferențial în care organisme-organisme au părtinire de utilizare a codonilor.
puteți găsi mai multe tabele codon care arată care codoni codifica care aminoacizi (a se vedea exemplul din dreapta). Cu astfel de reguli simple, s-ar putea să credeți că este ușor să veniți cu o secvență ADN funcțională pentru a codifica peptida de interes și a produce acea peptidă în organismul ales. Din păcate, preferințele codonului o fac astfel încât să nu puteți alege dintre codonii posibili la întâmplare și să vă așteptați ca secvența dvs. să se exprime bine în orice organism.
deci, care sunt constrângerile evolutive care duc la aceste preferințe și ce putem face în legătură cu ele? Citiți mai departe pentru a afla!
de ce organismele au diferite prejudecăți de utilizare a codonilor?
motivele preferințelor variate ale codonilor între organisme nu sunt complet înțelese, dar unele motive posibile includ:
- presiuni metabolice-este nevoie de resurse celulare pentru a produce Arnt care recunosc codoni diferiți, modifică Arnt corect și încarcă Arnt cu aminoacizii corespunzători. Dacă un organism folosește doar un subset de codoni, trebuie doar să producă un subset de Arnt încărcate și, prin urmare, poate avea nevoie de mai puține resurse pentru întregul proces de traducere. De exemplu, în condiții de rată ridicată de creștere, E. coli reglează în mod preferențial producția de Arnt care recunosc codonii găsiți în gene foarte exprimate (Emilsson și Kurland, 1990).
- controlul expresiei genelor prin secvența genelor – proteinele care sunt codificate de codoni cu abundență scăzută sau Arnt slab încărcate pot fi produse la o rată mai mică decât proteinele codificate de Arnt foarte abundente și încărcate. De exemplu Tuller și colab. s-a constatat că eficiența traducerii este bine corelată cu părtinirea codonilor atât în E. coli, cât și în S. cerevisiae.
- plierea proteinelor – dacă o proteină este codificată de un amestec de codoni cu Arnt puternic și slab încărcat, diferite regiuni ale proteinei pot fi traduse la rate diferite. Ribozomul se va deplasa rapid de-a lungul regiunilor care solicită Arnt abundente, încărcate, dar se va opri în regiunile care solicită abundență scăzută, Arnt slab încărcate. Când ribozomul se oprește, acest lucru poate oferi regiunilor traduse rapid șansa de a se plia corect. De exemplu, Pechmann și Frydman au descoperit că tracturile de codoni non-optimi sunt asociate cu structuri secundare specifice în 10 tulpini de drojdie strâns legate.
- adaptarea la condițiile în schimbare – organismele trebuie adesea să exprime gene la diferite niveluri în condiții diferite. Cu o utilizare variată a codonilor, un organism poate schimba ce proteine sunt foarte exprimate și care sunt slab exprimate prin producerea și încărcarea bazinelor specifice de Arnt. De exemplu, Arnt-urile utilizate în genele care codifică enzimele biosintetice ale aminoacizilor pot fi încărcate preferențial în timpul înfometării aminoacizilor, rezultând astfel o producție mai mare de enzime biosintetice ale aminoacizilor (Dittmar și colab., 2005).
cum afectează părtinirea utilizării codonului experimentele mele?
în timp ce preferințele codonilor pot fi foarte utile pentru organisme, ele pot fi problematice pentru cercetătorii care încearcă să exprime proteine în gazdele heterologe. Dacă pur și simplu amplificați o genă de interes din genomul uman, de exemplu, este posibil să nu se exprime deloc în E. coli (puteți găsi o varietate de baze de date care arată preferințele codonilor diferitelor organisme online). Chiar dacă gena este tradusă, este posibil să nu funcționeze corect. Acesta este rezultatul unei nepotriviri între preferința codonului uman și E. coli. Unii codoni utilizați în mod obișnuit la om nu sunt deloc obișnuiți în E. coli și invers. La traducerea acestor codoni, ribozomul poate, prin urmare, să se oprească în locații inadecvate sau să nu reușească să treacă prin întreaga transcriere, rezultând producerea de proteine nefuncționale și, respectiv, fragmente de proteine.
rezolvarea problemei utilizării codonului bias – optimizarea codonului și expresia Arnt alternative
optimizarea codonului
cu sinteza ADN-ului cu costuri reduse, una dintre principalele modalități prin care cercetătorii rezolvă problema alegerii codonului este resintetizarea genelor în așa fel încât codonii lor să fie mai potriviți pentru gazda de Expresie dorită. Acest lucru este cunoscut sub numele de ” optimizare codon.”Deși simplu în teorie, acest lucru nu este atât de ușor pe cât pare. Chiar și pentru peptidele relativ scurte, pot exista multe modalități posibile de a le codifica și ceea ce constituie codonul „adecvat” nu este neapărat evident.
s-ar putea să vă gândiți: „prostii! Ar trebui să aleg doar codonul cu cel mai abundent bazin de Arnt încărcate în organismul meu gazdă pentru fiecare aminoacid aș dori să codifice,” dar, așa cum este descris mai sus, nu fiecare regiune a unei proteine ar trebui neapărat să fie tradus rapid pentru a produce o proteină care funcționează corect.
s-ar putea să vă gândiți atunci: „bine, mă voi asigura că abundența codonilor pe care îi aleg pentru gazdă se potrivește cu abundența codonilor folosiți în organismul nativ.”Aceasta este probabil o idee mai bună și a fost folosită cu succes în trecut (Angov și colab., 2008), dar există încă multe alte caracteristici de luat în considerare la proiectarea unei gene complete. O listă neexhaustivă include:
- abundența codonilor în raport cu abundența Arnt înrudită
- secvențe Repetitive
- site – uri de restricție
- secvențe predispuse să creeze structuri secundare în transcrierile ARN
- efecte asupra transcrierii (amintiți-vă, nu este vorba despre Traducere-de exemplu, alegerea codonului poate întrerupe site-urile de legare a factorului de transcriere)
după cum vă puteți imagina, nu este ușor pentru oameni să echilibreze toți acești factori pe cont propriu. Din fericire, mulți cercetători au creat algoritmi de optimizare a codonilor și companii de sinteză a ADN-ului, cum ar fi IDT și genscript host online codon optimization tools. Rețineți că, doar pentru că optimizați o genă cu unul dintre aceste instrumente, nu înseamnă neapărat că gena se va exprima bine. Dacă obțineți o expresie bună, ar trebui, de asemenea, să analizați funcțional proteina produsă pentru a vă asigura că s-a pliat corect.
este posibil să puteți evita optimizarea codonului genelor dvs. de interes prin ordonarea plasmidelor care le conțin din Addgene. Dacă o plasmidă la Addgene conține o genă care a fost codon optimizat pentru un anumit organism, acest lucru va fi observat uneori (dar nu întotdeauna) în câmpul „mutație” de pe pagina plasmidei (vezi plasmida 87904 de exemplu). Deoarece multe plasmide disponibile de la Addgene au acum date complete de secvență, vă recomandăm să analizați direct secvențele genetice pentru optimizarea codonilor și adecvarea pentru gazda dvs. de Expresie înainte de a le utiliza în experimentele dvs.
expresia Arnt alternative
dacă nu aveți timp sau fonduri pentru a sintetiza o versiune optimizată codon a genei dvs. de interes, este posibil să supraexprimați Arnt cu abundență scăzută în gazda dvs. de expresie și, prin urmare, să creșteți abundența lor. De exemplu, tulpinile comerciale Rosetta E. coli exprimă o varietate de Arnt care se găsesc în mod normal la abundență scăzută în E. coli.
avantajul producerii de Arnt suplimentare este că puteți utiliza același sistem de Expresie pentru multe gene diferite fără a fi nevoie să creați noi construcții. Cu toate acestea, din cauza unor probleme cum ar fi ratele de traducere nepotrivite și efectele potențiale asupra creșterii celulare, chiar și gazdele care produc Arnt alternative pot să nu exprime cantități suficiente de proteine de interes.
indiferent de metoda pe care o alegeți pentru a depăși problemele legate de alegerea codonului, ar trebui să aveți o metodă pentru a vă asigura că proteinele pe care le produceți funcționează corect. Supraexprimarea poate duce la producerea de globuri insolubile, nefuncționale de proteine cunoscute sub numele de corpuri de incluziune care se vor separa în general cu peleta celulară în timpul procedurilor de purificare. Chiar dacă produceți o cantitate mare de proteine în gazda dvs. de exprimare la alegere, ar trebui să efectuați un test funcțional pentru a vă asigura că proteina dvs. nu formează corpuri de incluziune și se pliază corect.
1. Angov, Evelina și colab. „Expresia proteinelor heterologe este îmbunătățită prin armonizarea frecvențelor de utilizare a codonilor genei țintă cu cele ale gazdei expresiei.”PloS one 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PubMed PMCID Centrală: PMC2364656.
2. Dittmar, Kimberly A. și colab. „Încărcarea selectivă a izoacceptorilor Tarn indusă de foametea aminoacizilor.”Rapoartele EMBO 6.2 (2005): 151-157. PubMed PMID: 15678157. PubMed PMCID Centrală: PMC1299251.
3. Emilsson, Valur și Charles G. Kurland. „Dependența ratei de creștere a abundenței ARN de transfer în Escherichia coli.”Jurnalul EMBO 9.13 (1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611. PubMed PMCID Centrală: PMC552224.
4. Gustafsson, Claes, Sridhar Govindarajan și Jeremy Minshull. „Prejudecata codonului și expresia proteinelor heterologe.”Tendințe în biotehnologie 22.7 (2004): 346-353. PubMed PMID: 15245907.
5. Maertens, Barbara și colab. „Mecanisme de optimizare a genelor: un studiu multi‐genic relevă o rată ridicată de succes a proteinelor umane de lungime întreagă exprimate în Escherichia coli.”Știința Proteinelor 19.7 (2010): 1312-1326. PubMed PMID: 20506237. PubMed PMCID Centrală: PMC2970903.
6. Pechmann, Sebastian și Judith Frydman. „Conservarea evolutivă a optimității codonilor dezvăluie semnături ascunse ale plierii cotranslaționale.”Natura structurală & biologie moleculară20.2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PubMed PMCID Centrală: PMC3565066.
7. Quax, Tessa EF și colab. „Codon părtinire ca un mijloc de a ajusta expresia genelor.”Celula moleculară 59.2 (2015): 149-161. PubMed PMID: 26186290. PubMed PMCID Centrală: PMC4794256.
- această recenzie oferă o imagine de ansamblu excelentă a prejudecății de utilizare a codonului
8. Tuller, Tamir și colab. „Eficiența traducerii este determinată atât de părtinirea codonului, cât și de energia pliabilă.”Lucrările Academiei Naționale de științe 107.8 (2010): 3645-3650. PubMed PMID: 20133581. PubMed PMCID Centrală: PMC2840511.