1 Introducere
genele pentru proteinele transmembranare (TMPs) reprezintă 20-30% din majoritatea genomilor (Wallin & Heijne, 1998) și, pe baza rolurilor lor critice în fiziologia celulară, TMPs sunt țintele unei fracțiuni mari de medicamente utile din punct de vedere clinic. Astfel, determinarea structurilor și modurilor lor de acțiune are o importanță considerabilă. Cu toate acestea, numărul structurilor TMP de înaltă rezoluție disponibile rămâne relativ scăzut (a se vedea pagina web a lui Stephen White; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Două explicații care sunt invocate frecvent pentru dificultatea de a obține cristale bine difractante ale tmp – urilor pentru utilizare în studiile de difracție cu raze X sunt (1) tmp-urile sunt dinamice din punct de vedere structural, cu regiuni flexibile care îngreunează adoptarea conformației uniforme necesare pentru ambalarea într–un cristal; și (2) suprafețele regiunilor transmembranare ale tmp-urilor nu participă la fel de ușor ca suprafețele proteinelor solubile globulare în interacțiunile proteină-proteină care sunt necesare pentru ambalarea cristalelor. Introducerea unei proteine solubile stabile într-o regiune expusă la suprafață a unui TMP oferă o modalitate de a eluda potențial ambele probleme, deoarece o astfel de inserție într-o locație internă într-un TMP poate reduce flexibilitatea generală și deoarece prezența unui domeniu solubil ușor cristalizabil poate oferi contacte intermoleculare necesare pentru cristalizare (Chun și colab., 2012; Engel, Chen, & Cu Privire La 2002).
fuziunea lizozimului T4 (T4L) în locațiile interne din TMPs a oferit, până în prezent, o abordare reușită pentru determinarea structurilor diferiților membri ai importantei SUPERFAMILII GPCR (Cherezov și colab., 2007; Chien și colab., 2010; Dore și colab., 2014; Fenalti și colab., 2014; Granier și colab., 2012; Haga și colab., 2012; Hanson și colab., 2012; Hollenstein și colab., 2013; Jaakola și colab., 2008; Kruse și colab., 2012; Manglik și colab., 2012; Rosenbaum și colab., 2007, 2011; Shimamura și colab., 2011; Tan și colab., 2013; Wacker și colab., 2013; Wang și colab., 2013; White și colab., 2012; Wu și colab., 2010, 2012; Xu și colab., 2011; Zhang și colab., 2012). Fuziuni interne similare ale unui apocitocrom B stabilizat termic (Wacker și colab., 2013; Wang și colab., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta și colab., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang și colab., 2014) și rubredoxin (Tan și colab., 2013) au dat, de asemenea, structuri GPCR. În plus, mai multe structuri GPCR au fost obținute prin cristalizarea constructelor în care partenerul proteic stabilizator a fost fuzionat la capătul N al secvenței receptorului, mai degrabă decât la o poziție internă (Fenalti și colab., 2014; Rasmussen, Choi și colab., 2011; Rasmussen, DeVree și colab., 2011; Siu și colab., 2013; Thompson și colab., 2012; Wu și colab., 2014), sugerând că rolul proteinelor de fuziune în facilitarea formării contactelor intermoleculare poate fi mai important pentru promovarea cristalizării decât reducerea flexibilității TMP. Abordările Alternative pentru obținerea structurilor GPCR care nu implică utilizarea proteinelor de fuziune au inclus cocristalizarea cu anticorpi anti-receptor (Kruse și colab., 2013; Rasmussen, Choi și colab., 2011; Rasmussen și colab., 2007; Rasmussen, DeVree și colab., 2011; Ring și colab., 2013) și cristalizarea variantelor GPCR care au fost termostabilizate prin introducerea mutațiilor punctuale și a ștergerilor (Egloff și colab., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). De fapt, majoritatea variantelor GPCR care conțin proteine de fuziune utilizate pentru determinarea cu succes a structurii au încorporat, de asemenea, mutații punctuale și trunchieri concepute pentru a spori și mai mult stabilitatea proteinelor și a reduce flexibilitatea.
inserarea proteinelor solubile stabile în TMPs în scopul promovării cristalizării a fost efectuată în general ca o inserție sau înlocuire a reziduurilor în a treia buclă intracelulară (IC3) a GPCR-urilor. Aceasta se bazează pe așteptarea că această regiune din receptori este flexibilă și poate controla mișcarea relativă a helicelor înconjurătoare (Rosenbaum și colab., 2007), precum și reducerea probabilității ca inserția partenerului de fuziune să perturbe structura generală GPCR (Chun și colab., 2012). În timp ce astfel de inserții nu perturbă adesea structurile generale ale receptorilor (pe baza reținerii a cel puțin a unei afinități de legare a ligandului de către construcțiile de fuziune), acestea duc, în general, la pierderea capacității de a activa proteina G trimerică înrudită (Rosenbaum și colab., 2007), ceea ce nu este surprinzător, deoarece bucla IC3 este adesea locul interacțiunilor funcționale dintre GPCR-uri și proteinele g trimerice care sunt efectorii lor imediați din aval. În plus, criteriile pentru stabilirea anumitor locuri de joncțiune pentru inserarea proteinelor de fuziune și pentru determinarea cantității de secvență de receptori pe care le înlocuiesc nu sunt bine stabilite. O fuziune reușită trebuie să ofere o potrivire optimă între distanța și orientarea terminalelor N și C ale proteinei inserate și locurile de joncțiune din GPCR (Chun și colab., 2012; Engel și colab., 2002). Astfel, crearea unei fuziuni utile poate necesita sinteza sau construirea mai multor versiuni ale genelor topite (Rosenbaum și colab., 2007).
descriem aici o strategie pentru generarea și screeningul unei biblioteci de forme variante ale unui receptor care conține inserții de T4L în diferite puncte ale celei de-a treia bucle intracelulare (IC3) ca înlocuitor pentru un număr diferit de reziduuri de aminoacizi din secvența buclei (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Prin exprimarea receptorilor în drojdie, este posibil să se creeze biblioteci randomizate de variante cu inserții de lizozimă și să se analizeze direct constructe cu niveluri maxime de Expresie generală, Numere de site-uri de legare a ligandului la suprafața celulei și chiar funcția receptorului, testată pe baza activării proteinei g înrudite. Abordările au avut succes în identificarea receptorilor cu inserții în bucla IC3 care păstrează funcția de semnalizare aproape completă. Acest lucru sugerează că, atunci când este atașat prin secvențe de legătură adecvate, molecula T4L poate fi inserată în această buclă fără a împiedica accesul proteinei G la suprafețele relevante ale receptorului activat.
protocoalele descrise au fost dezvoltate folosind Ste2p, un GPCR endogen al drojdiei Saccharomyces cerevisiae utilizat ca sistem inițial tratabil pentru care nu este încă disponibilă o structură tridimensională. Cu toate acestea, abordări similare ar putea fi utilizate pentru a identifica variantele care conțin inserție ale numeroaselor GPCR-uri de mamifere care au fost raportate a fi capabile să activeze calea de răspuns a feromonilor de drojdie (Brown și colab., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), sau la alte tmp-uri pentru care este posibilă testarea funcției în celulele intacte. Mai mult, speciile de drojdie au fost utilizate ca sisteme de Expresie pentru determinarea structurii GPCR-urilor și a altor tmp-uri (Clark și colab., 2010), inclusiv pentru determinarea structurii cristaline a receptorului histaminic H1 uman (Shimamura și colab., 2011; Shiroishi și colab., 2011). Ste2p este receptorul pentru feromonul de împerechere a drojdiei, factorul X, o peptidă cu 13 reziduuri. Legarea acestui ligand are ca rezultat activarea unei proteine G heterotrimerice citoplasmatice, care, la rândul său, activează o cale a kinazei MAP, ducând în cele din urmă la răspunsuri transcripționale, modificări ale formei celulare, oprirea ciclului celular și fuziunea cu celule de drojdie de tipul opus de împerechere.