Che cosa è metabolomics tutto circa?

Che cosa è metabolomics?

Il campo rapidamente emergente della metabolomica combina strategie per identificare e quantificare i metaboliti cellulari utilizzando sofisticate tecnologie analitiche con l’applicazione di metodi statistici e multi-variante per l’estrazione delle informazioni e l’interpretazione dei dati. Negli ultimi due decenni sono stati fatti enormi progressi nel sequenziamento di un certo numero di organismi diversi. Contemporaneamente, sono stati fatti grandi investimenti per sviluppare approcci analitici per analizzare i diversi prodotti cellulari, come quelli dell’espressione genica (trascritti), delle proteine e dei metaboliti. Tutti questi cosiddetti approcci omici, tra cui genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica, sono considerati strumenti importanti da applicare e utilizzare per comprendere la biologia di un organismo e la sua risposta agli stimoli ambientali o alle perturbazioni genetiche.

I metaboliti sono considerati “agire come linguaggio parlato, trasmettendo segnali dall’architettura genetica e dall’ambiente” (1), e quindi, la metabolomica è considerata fornire una “lettura funzionale diretta dello stato fisiologico” di un organismo (2). Una gamma di tecnologie analitiche è stata impiegata per analizzare i metaboliti in diversi organismi, tessuti o fluidi (per la revisione vedere Riferimento 3). La spettrometria di massa accoppiata a diverse tecniche di separazione cromatografica, come la cromatografia liquida o gassosa o la NMR, sono i principali strumenti per analizzare simultaneamente un gran numero di metaboliti. Sebbene la tecnologia sia altamente sofisticata e sensibile, ci sono ancora alcuni colli di bottiglia nella metabolomica. A causa dell’enorme diversità delle strutture chimiche e delle grandi differenze in abbondanza, non esiste una singola tecnologia disponibile per analizzare l’intero metaboloma. Pertanto, è necessario stabilire una serie di approcci complementari per l’estrazione, l’individuazione, la quantificazione e l’identificazione del maggior numero possibile di metaboliti (3,4).

Un’altra sfida nella metabolomica è estrarre le informazioni e interpretarle in un contesto biologico dalla grande quantità di dati prodotti dagli analizzatori ad alto throughput. L’applicazione di sofisticati strumenti di analisi dei dati statistici e multi-variante, tra cui l’analisi dei cluster, la mappatura dei percorsi, le sovrapposizioni comparative e le heatmap, non è stata solo un processo di apprendimento eccitante e ripido per i biochimici, ma ha anche dimostrato che il pensiero attuale deve cambiare per gestire grandi set di dati e distinguere tra rumore e informazioni Inoltre, e ancora senza consenso nella comunità metabolomica, è la domanda, ” Come facciamo a trattare con i dati che non hanno senso biologico sulla base di letteratura e conoscenza comune?”Stiamo solo iniziando ad assumere anche dove la metabolomica, insieme alle altre tecnologie omiche, ci porterà: troveremo più risposte alle nostre domande o porterà più domande che richiedono più risposte?

Potenziale e applicazioni di metabolomics

Ci sono quattro approcci concettuali in metabolomics: analisi dell’obiettivo, profilo del metabolita, metabolomics e fingerprinting metabolico (5). L’analisi target è stata applicata per molti decenni e include la determinazione e la quantificazione di un piccolo insieme di metaboliti noti (target) utilizzando una particolare tecnica analitica di migliori prestazioni per i composti di interesse. La profilazione dei metaboliti, invece, mira all’analisi di un insieme più ampio di composti, sia identificati che sconosciuti rispetto alla loro natura chimica. Questo approccio è stato applicato per molti diversi sistemi biologici che utilizzano GC-MS, tra cui piante (6), microbi (7), urina (8) e campioni di plasma (9). La metabolomica impiega metodologie analitiche complementari, ad esempio LC-MS/MS, GC-MS e/o NMR, al fine di determinare e quantificare il maggior numero possibile di metaboliti, composti identificati o sconosciuti. Il quarto approccio concettuale è la finger-printing metabolica (o footprinting per metaboliti esterni e/o secreti). Qui viene generata una “firma” metabolica o un profilo di massa del campione di interesse e quindi confrontato in una vasta popolazione di campioni per esaminare le differenze tra i campioni. Quando vengono rilevati segnali che possono discriminare significativamente tra i campioni, i metaboliti vengono identificati e la rilevanza biologica di tale composto può essere chiarita, riducendo notevolmente il tempo di analisi.

Poiché i metaboliti sono strettamente legati al fenotipo di un organismo, la metabolomica può essere utilizzata per una vasta gamma di applicazioni, tra cui la fenotipizzazione di piante geneticamente modificate e test di equivalenza sostanziale, la determinazione della funzione genica e il monitoraggio delle risposte allo stress biotico e abiotico. La metabolomica può quindi essere vista come un ponte tra genotipo e fenotipo (5), fornendo una visione più completa di come funzionano le cellule, oltre a identificare cambiamenti nuovi o sorprendenti in metaboliti specifici. L’analisi e il data mining dei set di dati metabolomici e dei loro metadati possono anche portare a nuove ipotesi e nuovi obiettivi per la biotecnologia.

Metabolomica ed evoluzione

Ad oggi, la maggior parte delle ricerche in evoluzione si basa sulla costruzione di alberi filogenetici di specie utilizzando sequenze di genomi, geni, mRNA e/o proteine. Tuttavia, la correlazione tra espressione genica e proteica è bassa e quella tra espressione genica e metaboliti ancora più bassa. Tuttavia, i metaboliti, specialmente i metaboliti secondari, sono estremamente importanti per la maggior parte degli organismi per difendersi da ambienti stressanti o predatori. Sebbene i metaboliti primari coinvolti nel metabolismo centrale possano essere utilizzati per determinare lo stato nutrizionale e di crescita, i profili dei metaboliti secondari possono riflettere meglio la differenziazione delle specie e la loro complessa risposta ai fattori ambientali e ad altri organismi. La serie di metaboliti secondari in un organismo può essere sorprendentemente complessa, e mentre alcuni composti possono essere trovati in diversi organismi, un vasto numero di composti sono molto specie-specifici. I metaboliti secondari sono quindi considerati potenziali marcatori per la tassonomia e la filogenetica (10).

Probabilmente le migliori e più eccitanti applicazioni degli strumenti di metabolomica per distinguere diverse specie fungine sono state riassunte da Smedsgaard e Nielsen (11). La spettrometria di massa elettro-spray per infusione diretta (DiMS) è stata utilizzata per una rapida classificazione chimica dei funghi filamentosi. Estratti fungini grezzi di diverse sottospecie sono stati iniettati direttamente in uno spettrometro di massa e i profili di massa risultanti sono stati confrontati utilizzando strumenti di analisi chemometrica (4). Oltre l ‘ 80% delle specie analizzate potrebbe essere classificato in base al loro profilo di massa rispetto a un’identificazione fenotipica convenzionale.

Nel nostro laboratorio, utilizziamo la metabolomica per determinare nuovi meccanismi di adattamento e tolleranza delle piante agli stress abiotici, come siccità, salinità, freddo, gelo e carenze o tossicità minerali (www.acpfg.com.au). Le nostre principali piante di interesse sono i cereali, come l’orzo e il grano, ma guardiamo anche a piante modello o piante che sono noti per mostrare un maggiore livello di tolleranza a una certa condizione di stress. Il confronto tra le risposte di diverse specie a diversi stress ha dimostrato che ci sono un certo numero di risposte che sono specifiche per lo stress e/o per le piante e alcune che sono comuni tra stress e/o piante. Pertanto, abbiamo deciso di confrontare i livelli di metaboliti nelle foglie di quattro diverse specie: il muschio Physcomitrella patens, la pianta modello Arabidopsis thaliana, e le piante coltivate Hordeum vulgare L. e Triticum aestivum L. Abbiamo confrontato i livelli di metaboliti nelle piante non accentate per indagare se esiste una correlazione tra livelli di tolleranza e profili di metaboliti. Abbiamo usato GC-MS per profilare metabol 140 metaboliti noti (12) e normalizzato i dati per il confronto tra le specie. L’analisi multivariata del set di dati risultante utilizzando la componente principale o l’analisi gerarchica dei cluster ha dimostrato che i profili dei metaboliti delle quattro specie sono molto distinti, con i profili delle foglie di orzo e grano più simili (Figura 1A). La prima componente di principio separava il grano e l’orzo dalle altre due specie, rappresentando il 58% della variabilità dell’intero set di dati. La figura 1B mostra una rappresentazione della mappa di calore dello stesso insieme di dati che confronta i livelli di metaboliti delle diverse specie. La maggior parte dei metaboliti si trova a un livello molto più basso nel muschio e nell’Arabidopsis rispetto all’orzo e al grano (dati grezzi non mostrati). Ci sono alcune eccezioni, tra cui urea, glicerolo, tiramina, allantoina, tocoferolo, xilitolo, fucosio e inositolo, che sono.trovato a livelli molto più alti nel muschio che in tutte le altre specie. Ciò solleva la questione se tali metaboliti possano essere responsabili dell’elevata tolleranza del muschio agli stress abiotici (13).

Questo esempio dimostra il potenziale della metabolomica da utilizzare per l’identificazione e la classificazione degli organismi. Gli esempi sopra menzionati possono essere solo l’inizio. Riteniamo che valga la pena di perseguire uno studio più sistematico per confrontare i profili dei metaboliti tra un numero maggiore di organismi utilizzando approcci analitici complementari per coprire il maggior numero possibile di metaboliti e per indagare se i profili dei metaboliti sono correlati alle relazioni filogenetiche ed evolutive tra organismi. Questo tipo di studio può portare a nuove intuizioni nell’evoluzione dei percorsi, dei meccanismi di sopravvivenza e della vita in generale.

Metabolomics in un contesto di biologia dei sistemi

Come abbiamo descritto in questo articolo, metabolomics mira idealmente all’analisi di tutte le piccole molecole in una cellula. Questa è solo una parte dei prodotti cellulari all’interno di una cellula. Per un approccio di biologia dei sistemi, metabolomics fornisce soltanto la misura di una parte di tutti gli elementi in un sistema biologico. Tuttavia, la biologia dei sistemi comprende non solo la capacità di misurare tutti gli elementi di un sistema, come il DNA, l’mRNA, le proteine, i metaboliti e gli elementi strutturali come le pareti cellulari e le membrane, ma anche di determinare la relazione di tali elementi tra loro come parte della risposta del sistema alle perturbazioni ambientali o genetiche. Dopo aver integrato tutti i diversi livelli di informazione, l’intenzione è quella di modellare il comportamento del sistema utilizzando metodi computazionali che possono consentire la descrizione del comportamento del sistema sotto qualsiasi tipo di perturbazione. Un approccio di biologia dei sistemi richiede biologi, fisici, informatici, ingegneri, chimici e matematici per imparare un linguaggio comune che permette loro di comunicare tra loro. Un altro requisito importante per un approccio di biologia dei sistemi di successo è la creazione di un ambiente che fornisce l’accesso a tutte le piattaforme ad alto throughput necessarie per ottenere e misurare le proprietà e gli elementi del sistema di interesse. Inoltre, un approccio efficace alla biologia dei sistemi deve offrire l’opportunità e la scala per un rapido sviluppo e impiego di nuove tecnologie globali e potenti strumenti computazionali che consentano di raccogliere, classificare, analizzare, integrare e, in definitiva, modellare le informazioni biologiche.

Gli approcci sistemici alle malattie umane, come il cancro, le malattie cardiovascolari e l’obesità, daranno l’opportunità di facilitare notevolmente il successo della selezione di un nuovo obiettivo per i trattamenti e lo sviluppo di farmaci. In futuro, la biologia dei sistemi potrebbe permetterci di sviluppare nuovi approcci in medicina che saranno predittivi, preventivi e personalizzati. L’obiettivo sarebbe quello di raggiungere la capacità di determinare una storia di salute probabilistica per ogni individuo, e in questo quadro, la biologia dei sistemi sarà una strategia per la scoperta e lo sviluppo di nuovi farmaci terapeutici e preventivi.

In sintesi, lo studio della risposta di vari organismi a diversi stress e ambienti a livelli genetici, trascritti, proteici e metaboliti utilizzando metodi diversi e confrontando questi risultati con quelli di altri organismi rafforzerà la loro integrazione in un quadro di biologia dei sistemi. Man mano che il quadro si sviluppa, la maggiore sinergia tra organismi fornirà un quadro molto più chiaro della funzione di cellule, organi e organismi, portandoci più vicini alla comprensione dei loro ruoli in natura.