Cromatografia di filtrazione del gel

Applicazioni della cromatografia di filtrazione del gel

La cromatografia di filtrazione del gel, un tipo di cromatografia di esclusione di dimensione, può essere usata per frazionare le molecole ed i complessi in un campione nelle frazioni con una gamma di dimensione particolare, per rimuovere tutte le molecole più grandi di una dimensione particolare dal campione, o La cromatografia di filtrazione del gel può essere usata per separare i composti quali le piccole molecole, le proteine, i complessi della proteina, i polisaccaridi e gli acidi nucleici quando in soluzione acquosa. Quando un solvente organico è usato come la fase mobile, il processo è invece indicato come cromatografia di permeazione del gel.

La cromatografia di filtrazione del gel può anche essere usata per:

• Frazionamento delle molecole e complessi all’interno di un determinato intervallo di grandezza
• Capacità di analisi e di determinazione
• Rimozione di grandi proteine e complessi
• scambio di Buffer
• Dissalazione
• Rimozione di piccole molecole quali nucleotidi, primer, coloranti, e contaminanti
• Valutazione di un campione di purezza
• Separazione di associato da unbound radioisotopi

cromatografia di Gel filtrazione media per tutti gli usi di cui sopra sono disponibili in preconfezionati di flusso per gravità colonne, spin colonne, a bassa pressione e colonne cromatografiche a media pressione e resine imbottigliate.

Meccanismo della cromatografia di filtrazione del gel

In una colonna della cromatografia di filtrazione del gel, la fase stazionaria è composta di una matrice porosa e la fase mobile è l’amplificatore che scorre fra le perle della matrice. Le perle hanno un intervallo di dimensioni dei pori definito, noto come intervallo di frazionamento. Molecole e complessi che sono troppo grandi per entrare nei pori rimangono nella fase mobile e si muovono attraverso la colonna con il flusso del buffer. Molecole e complessi più piccoli che sono in grado di muoversi nei pori entrano nella fase stazionaria e si muovono attraverso la colonna di filtrazione del gel da un percorso più lungo attraverso i pori delle perline.

Qualsiasi molecola o complesso al di sopra dell’intervallo di frazionamento per una particolare colonna di cromatografia per filtrazione su gel si muoverà attraverso la colonna più velocemente di qualsiasi molecola che possa entrare nella fase stazionaria. Pertanto, qualsiasi costituente nel campione che si trova al di sopra dell’intervallo di frazionamento elutterà per primo (nel volume vuoto) prima di tutto ciò che si trova nell’intervallo di frazionamento. La dimensione minima che rimarrà nella fase mobile e non entrerà nella fase stazionaria è nota come limite di esclusione. Bio-Rad offre supporti per cromatografia a filtrazione su gel e colonne con limiti di esclusione che vanno oltre tre ordini di grandezza, da 100 daltons a 100.000 daltons (100 kDa).

Molecole e complessi che possono entrare nella fase stazionaria saranno frazionati in base alle loro dimensioni. Le molecole più piccole migreranno in profondità nei pori e saranno ritardate più delle molecole più grandi che non entrano così facilmente nei pori e vengono quindi eluite dalla colonna più rapidamente. Questa differenza nella migrazione dei pori porta al frazionamento dei componenti per dimensione con il primo eluimento più grande.

Nelle colonne di cromatografia per filtrazione in gel progettate per la dissalazione, lo scambio tampone e la rimozione di piccole molecole come i nucleotidi, i sali e i piccoli composti entrano prontamente nei pori, sono ritardati e migrano più lentamente attraverso la colonna rispetto alle proteine più grandi o agli acidi nucleici. Pertanto, i componenti di interesse nel campione vengono eluiti in anticipo di sali, nucleotidi,ecc. I kit di pulizia del DNA che utilizzano questo meccanismo contengono spesso colonne di spin di filtrazione del gel.

La risoluzione, qui definita come la nitidezza dei confini tra le frazioni di dimensione, è determinata dalla dimensione del tallone e da una serie di altri fattori. La dimensione del tallone più piccola produce generalmente una risoluzione più elevata in una colonna di cromatografia per filtrazione su gel. Le molecole compatte si diffondono attraverso la fase stazionaria più velocemente delle molecole lineari. L’esclusione delle dimensioni, l’intervallo di frazionamento e la velocità di eluizione sono influenzati dalla composizione del buffer, dalla forza ionica e dal pH. Per il frazionamento di miscele complesse di proteine, i tempi di eluizione e i limiti di esclusione delle dimensioni possono essere determinati empiricamente.

Gel filtrazione cromatografia Media

Un criterio importante per gel filtrazione cromatografia media è che i media è inerte e che nulla nel campione o qualsiasi buffer si lega al supporto. Un’altra considerazione è il tipo di colonna di filtrazione del gel che sta usando e se è utilizzata in un sistema pressurizzato della cromatografia o in flusso di gravità o nelle colonne di rotazione. Se viene utilizzato un sistema di cromatografia pressurizzata, sia la colonna che il supporto devono essere in grado di tollerare la pressione e le portate utilizzate.

I supporti comunemente usati per la cromatografia a filtrazione su gel sono basati su perline di agarosio o poliacrilammide, destrosio per sistemi a gravità o a bassa pressione e resine polimeriche per sistemi a media pressione. La scelta dei supporti dipende dalle proprietà dei componenti da separare e da altri fattori sperimentali. Le seguenti sono considerazioni generali quando si determina la scelta del gel filtrazione cromatografia media:

• Frazionamento gamma
• Dimensione del limite di esclusione
• pressione di esercizio
• Portata
• Esempio di viscosità
• intervallo di pH
• Autoclavability
• Tolleranza per l’acqua miscibile in solventi organici; alcuni esempi possono essere più solubile in acqua biologica mix
• Tolleranza per i detersivi, in agenti caotropici agenti, formammide, ecc.
• Temperatura di funzionamento

I tipi di campioni, la scelta dei supporti e la configurazione del sistema cromatografico determineranno quali parametri sono i più importanti per una determinata applicazione di purificazione.