forværring af substrattoksicitet med IPTG i Escherichia coli BL21(DE3), der bærer en syntetisk metabolisk vej

Biotransformation af TCP ved hvile E. coli BL21(DE3) celler, der bærer varianter af en syntetisk nedbrydningsvej

varianter af den syntetiske vej med enten vildtype haloalkane dehalogenase eller den 26 gange katalytisk mere effektive mutant DHAA31 blev introduceret i E. coli Bl21(DE3) . Denne vært blev valgt, fordi hverken TCP-vejens metabolitter forekommer naturligt i dets metaboliske netværk og på grund af det brede repertoire af kommercielt tilgængelige Duetvektorer til denne stamme, som muliggør den afstemmelige Co-ekspression af flere gener i en enkelt celle . Dette resulterede i konstruktionen af et fleksibelt system med begrænset risiko for metabolisk cross-talk, hvor ekspressionen af de tre vejkomponenter kunne manipuleres ortogonalt . Tre tidligere konstrueret E. coli BL21 (DE3) nedbrydningsstoffer, der er betegnet degvust, deg31 og deg31opt, blev testet (tabel 1). E. coli afgasning bærer en variant af TCP-stien baseret på vildtype DhaA sammen med HheC og EchA, udtrykt i et relativt forhold på henholdsvis 0,24:0,36:0,40 som bestemt efter præinduktion med 0,2 mM IPTG (yderligere fil 1: Fig. S1). Stammer deg31 og deg31opt bærer begge TCP-stien med den konstruerede dehalogenase DhaA31, men det relative forhold mellem de tre enheder i deg31 er 0,14:0,41:0,45, mens det i deg31opt er 0,63:0,16:0,21. Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) eksperimenter viste, at de tre veje tilsammen tegnede sig for en tilsvarende andel af den samlede opløselige proteinfraktion produceret af alle tre nedbrydere: 52% for nedbrydning, 54% for deg31 og 44% for deg31opt.

præ-induceret (0.2 mM IPTG) hvilende celler af hver af de rekombinante stammer og en værtskontrol (tabel 1) blev inkuberet i phosphatbuffer med 2 mM TCP, og tidskurserne for TCP biotransformation over et 5 h interval blev registreret (Fig. 1). Reaktionsprofilerne afslørede grundlæggende forskelle mellem stammerne med hensyn til de indledende hastigheder for TCP-dehalogenering, akkumulering af mellemprodukter og den samlede effektivitet af glyceroldannelse. De teoretiske koncentrationer af glycerol, ellers hurtigt udnyttet af E. coli, kunne beregnes ud fra de eksperimentelle koncentrationer af TCP og detekterede mellemprodukter i kraft af vejens ortogonale natur . Mens deg31opt nydt godt af det hurtigste første skridt (Fig. 1d) var den bedst afbalancerede vej med den højeste glycerolproduktion deg31 (Fig. 1c). På den anden side led afgasning af langsom TCP-konvertering (Fig. 1b), langvarig eksponering for det giftige substrat og utilstrækkelig vejudgang. Som forventet er værtsstyringen (bærer de tilsvarende tomme plasmider, Fig. 1a) viste ingen aktivitet mod TCP i det lukkede batchsystem.

de tre E. coli-rekombinanter og kontrolstammen, der mangler den syntetiske vej, repræsenterer et egnet modelsystem til undersøgelse af bidraget fra metabolisk byrde og substrat/metabolittoksicitet til egnethedsomkostningerne ved TCP-biotransformation af helcellekatalysatorer.

vurdering af metabolisk byrde og substrattoksicitetseffekter ved plettering

Cellelevedygtighed, estimeret ved plettering, er en vigtig fysiologisk parameter, der skal afspejle de enkelte stammers evne til at klare de belastninger, der er forårsaget af den metaboliske byrde og TCP-eksponering . E. coli nedbryder præinduceret med 0.2 mM IPTG-og værtskontroller blev belagt før og efter 5 timers inkubation i fosfatbuffer med eller uden 2 mM TCP. Procentdelen af overlevende celler blev beregnet efter inkubation.

dataene opnået fra plettering før inkubation (Fig. 2A) illustrere de separate virkninger af individuelle elementer af den samlede metaboliske byrde, der pålægges cellerne. Flere faktorer, herunder tilstedeværelsen af plasmid-DNA og de tilknyttede selektionsmarkører, tilsætningen af IPTG og byrden på grund af heterolog vejekspression påvirkede nedbrydernes levedygtighed parallelt, selv før tilsætningen af det toksiske substrat. Den mest udtalte virkning på dette stadium skyldtes plasmidvedligeholdelse og den tilhørende konstitutive ekspression af selektionsmarkørgener fra Duetvektorerne samt tilstedeværelsen af IPTG. Tilstedeværelsen af to mellemstore til høje kopiplasmider pCDF (20-40 kopier pr.celle) og pETDuet (~40 kopier pr. celle) reducerede levedygtigheden med 50% (P < 0,01; Fig. 2a). “Præinduktionen” af værtskontrollen med tomme plasmider reducerede levedygtigheden med næsten 40% i forhold til den ikke-inducerede kontrol (P < 0,01). 20 % (P < 0,05). Yderligere reduktion af levedygtigheden af deg31opt sammenlignet med degvust og deg31 kan potentielt tilskrives forskellen i antibiotiske selektionsmarkører blandt tre rekombinanter.

de indsamlede data efter 5 h inkubation med eller uden TCP (Fig. 2b og yderligere fil 1: Fig. S2) omfattede flere uventede observationer. Overraskende havde TCP (oprindeligt tilsat i en koncentration på 2 mM) kun mindre eller ubetydelige virkninger på levedygtigheden af ikke-inducerede kontrolceller, der bærer tomme plasmider; der var ingen signifikant forskel i levedygtighed mellem disse celler og værtskontrollerne, der hverken blev udsat for TCP eller IPTG. Dette var uventet, fordi TCP er blevet rapporteret at hæmme voksende celler af E. coli BL21(DE3) og naturlige værter som A. radiobacter AD1 eller Pseudomonas putida MC4 selv ved koncentrationer 50% lavere end dem, der anvendes her . På den anden side var den skadelige virkning af IPTG statistisk signifikant (P < 0,01) (Fig. 2b og yderligere fil 1: Fig. S2). Den mest slående observation var, at den relative levedygtighed af celler, der var præinduceret med IPTG og derefter udsat for TCP, var næsten 90% lavere end for værtskontroller, der blev udsat for hverken stof (P < 0,01) (Fig. 2b). Dette dramatiske tab af levedygtighed svarer ikke til en simpel sum af de to forbindelsers individuelle virkninger; det er indlysende, at IPTG forværrede toksiciteten af TCP. Det faktum, at IPTG forværrede toksiciteten af TCP og ikke omvendt, blev bekræftet ved plettering af tre rekombinanter, der bærer den syntetiske bionedbrydningsvej (Fig. 2b). Fordi disse nedbrydere havde funktionelle veje til TCP-nedbrydning, var de bedre i stand til at tolerere dets tilstedeværelse. Det er vigtigt, at jo hurtigere konverteringen af TCP ved hjælp af stien er, desto større er nedbrydernes levedygtighed. Deg31opt, som opnåede en hurtig indledende konvertering af TCP, men akkumulerede betydelige mængder af mellemprodukterne DCP og GDL, overlevede 5 h inkubationen næsten såvel som værtskontrollen, der ikke blev udsat for substratet. Disse data er i overensstemmelse med de tidligere rapporterede resultater af vækstarrestestest, hvilket indikerede, at TCP er den mest toksiske forbindelse i vejen .

vurdering af metabolisk byrde og substrattoksicitetseffekter ved multiparameterstrømningscytometri

multiparameterstrømningscytometri muliggør samtidig bestemmelse af flere biokemiske og fysiske variabler umiddelbart efter prøveforberedelse og bør derfor give mere nøjagtige oplysninger om cellernes fysiologiske status, end der kan opnås ved plettering . Denne teknik giver også nøgleinformation om heterogeniteten af bakteriepopulationer. I modsætning til plettering undervurderer det ikke antallet af levedygtige celler i originale kulturer i tilfælde, hvor en brøkdel af befolkningen har oplevet subletal skade og mistet evnen til at vokse .

inkubation af de tre nedbrydere og værtskontroller blev udført under de betingelser, der er nævnt i det foregående afsnit. Prøverne udtaget efter 5 timers inkubation med eller uden TCP blev farvet med propidiumiodid (PI), 6-carboksy-2′,7′-dichlordihydrofluoresceindiacetat (carboksy-H2DCFDA) eller bis-(1,3-dibutylbarbitursyre) trimethinoksonol . Farvestoffer til mærkning af nukleinsyrer, såsom PI, som kun kommer ind i celler med kompromitterede membraner, anvendes almindeligvis med membranpotentialfølsomme farvestoffer såsom DiBAC4(3), som binder de lipidholdige intracellulære komponenter for at studere bakteriel levedygtighed . Carboksy-H2DCFDA er en kemisk reduceret, acetyleret og carboksyleret form af fluorescein, der har fundet mange anvendelser som en generel indikator for tilstedeværelsen af reaktive iltarter (ROS) i eukaryote og prokaryote celler . Nylige undersøgelser af bakterieudnyttelse af chlorerede alifatiske carbonhydrider antyder, at denne proces er forbundet med stærk oksidativ stress, og vi antog, at TCP også ville fremkalde en sådan fysiologisk reaktion . En af de mest almindelige årsager til denne sygdom er, at en person er i stand til at bestemme, om han eller hun er i stand til at få adgang til en bestemt type ilt, og om han eller hun er i stand til at få adgang til det, han eller hun har brug for .

slutpunktsstrømningscytometriprotokollen, der blev vedtaget i vores undersøgelse, var mindre følsom end plettering ved at demonstrere byrden forårsaget af plasmider (Fig. 2b), muligvis fordi tilstedeværelsen af heterologt DNA og den konstitutive ekspression af selektionsmarkører ikke direkte ændrede egenskaber målrettet mod cytometri, men i stedet ubalancerede cellernes samlede energistatus. Imidlertid var strømningscytometri-tilgangen ved anvendelse af udvalgte fluorokromer nyttig til at udsætte de toksiske virkninger af IPTG og TCP. Der var ingen signifikante forskelle (P > 0.05) mellem de ikke-inducerede værtskontroller med tomme plasmider, uanset deres TCP-eksponeringsstatus, med hensyn til nogen af de tre variabler, der er undersøgt i disse eksperimenter (membranpermeabilitet, ROS-dannelse og membranpotentiale; se Fig. 2b). Andelen af celler, der farvedes positivt for DiBAC4 (3), steg imidlertid op til tredobbelt i kontrollen behandlet med IPTG alene (P < 0,01). Den samme effekt blev også observeret i deg31, hvis respons på induktion og inkubation med TCP blev undersøgt mere detaljeret (Fig. 3). Fraktionen af bakteriepopulationen farvning positivt med alle tre farvestoffer steg mange gange, når forbehandling med IPTG blev kombineret med TCP-eksponering, hvilket bekræfter den tidligere observerede forværrende virkning og indikerer, at virkningen af TCP i bakterieceller ledsages af omfattende ROS-dannelse (Fig. 2b, 3). Membran depolarisering, ROS-akkumulering og membranpermeabilitet blev reduceret i E. coli-rekombinanter, der udtrykte den syntetiske bionedbrydningsvej, hvor reduktionsgraden var proportional med Stammernes indledende hastigheder for TCP-konvertering. Interessant nok blev forværringen af forbindelsestoksicitet ved præinduktion af bl21(DE3) værtskontrol med IPTG bekræftet også i eksperimenter ved anvendelse af modellen giftig forbindelse tert-butylhydroperilte (TBHP), et organisk overilte og stærk ROS-dannelse, der fremmer iltningsmiddel (yderligere fil 1: Fig. S3). Dette antyder, at beskrevet eksacerbationsfænomen ikke kun bør begrænses til vores model giftige kemiske TCP.

membran depolarisering og ROS dannelse in vivo er dynamiske processer. For at følge deres kinetik i E. coli-nedbrydere udførte vi også tidsopløste målinger (yderligere fil 1: Fig. S4). Antallet af celler farvet af DiBAC4 (3) og carbacsy-H2DCFDA steg lineært over tid i alle de stressede rekombinanter undtagen deg31. Interessant nok udviste denne nedbryder en indledende udbrud af DiBAC4 (3) og carboksy-H2DCFDA fluorescens, men disse signaler blev derefter plateaued eller faldt lidt. Vi antager, at de karakteristiske profiler af DiBAC4(3) og carbacsy-H2DCFDA fluorescens for deg31 er knyttet til dens unikke variant af den syntetiske bionedbrydningsvej og det tilsvarende tidsforløb for TCP-biotransformation. I modsætning til de andre stammer var TCP, 2,3-dichlorpropan-1-ol (DCP) og glycidol (GDL) til stede ved relativt høje koncentrationer i deg31-reaktionsblandingen mellem minutter 50 og 100 af måleperioden. Dette kan have forårsaget synergistisk toksicitet, hvilket øger antallet af celler med depolariserede membraner og forbedret ROS-dannelse. Sådanne fælles virkninger er almindelige; de er blevet observeret for blandt andet organophosphatpesticider, fluorosurfaktanter og tungmetaller . Efterfølgende frysning eller moderat fald i intensiteten af signalerne blev tilskrevet den parallelle fjernelse af TCP og GDL og produktionen af glycerol, som vides at være et effektivt stressbeskyttende middel i gær-og opløsningsmiddeltolerante stammer af E. coli .

varianten af den syntetiske vej, der var til stede i deg31, syntes at give det bedste kompromis med hensyn til håndtering af toksicitet, mens den effektivt omdannede TCP til harmløs glycerol og blev derfor valgt til yderligere undersøgelse.

vurdering af metabolisk byrde og substrattoksicitetseffekter ved elektronmikroskopi

metabolisk byrde og toksicitet kan forårsage ændringer i morfologien hos bakterielle værter . Vi brugte derfor transmissionselektronmikroskopi til at studere ændringerne i morfologi af inducerede og ikke-inducerede deg31-celler efter 5 h inkubation med eller uden 2 mM TCP (Fig. 3). Billeder af inducerede og ikke-inducerede E. coli værtskontrolceller med tomme plasmider er vist i (yderligere fil 1: Fig. S5). Mikroskopiske observationer blev efterfulgt af multi-parameter strømningscytometri af deg31 celler farvet med PI, carboksy-H2DCFDA eller DiBAC4(3).

inkubation af ikke-inducerede nedbrydere med TCP producerede kun en lille del af døde bakterieceller, og morfologien af celler behandlet på denne måde adskiller sig generelt ikke fra cellerne, der ikke er eksponeret for det toksiske substrat (Fig. 3a, b). Andelen af celler farvet med carboksy-H2DCFDA og PI steg moderat, men der blev ikke observeret nogen effekt på membranpotentialet. Præinducerede bakterier, der producerede rekombinante proteiner, dannede intensivt synlige inklusionslegemer og viste hyppig adskillelse af den cytoplasmatiske membran fra den ydre membran ved polerne i cellen (Fig. 3c). Da størstedelen af de rekombinante proteiner opnået fra cellelysater var opløselige (data ikke vist), mener vi, at de observerede legemer bestod af aktive stoffer.

kombinationen af præ-induktion og inkubation med TCP frembragte de mest udtalte morfologiske ændringer og blev ledsaget af betydelige stigninger i antallet af celler, der farvede positivt for PI, carboksy-H2DCFDA og DiBAC4(3) (Fig. 3d). Talrige døde eller døende celler med beskadigede cytoplasmatiske membraner og lækket indhold var tydeligt synlige. Alligevel modstod en betydelig del af befolkningen de kombinerede virkninger af IPTG og TCP i løbet af 5 h behandlingsperioden. Dette skyldtes hovedsageligt den velafbalancerede syntetiske vej af deg31 og dens hurtige konvertering af TCP til glycerol. Bistabilitet er et almindeligt fænomen og kan tilskrives støj i ekspressionen af de multigene træk, der er ansvarlige for toksicitetstolerance og den graduerede stressrespons i bakteriepopulationen . Sammenfattende var vores mikroskopiske observationer af deg31-populationer behandlet under fire forskellige betingelser i overensstemmelse med tidligere resultater og understøttede konklusionen om, at præinduktion med IPTG forværrer TCP-toksicitet.

Toksicitetsforværringseffekt stiger i celler, der oplever metabolisk byrde fra plasmider

i betragtning af at både E. coli-nedbrydere og værtskontrollerne, der blev brugt i dette arbejde, skulle klare den metaboliske byrde af duet-plasmiderne og lacik/P lacUV5-T7-ekspressionssystemet, besluttede vi at inkludere E. coli-kontroller uden disse komponenter i det følgende eksperiment. Til dette formål brugte vi E. coli BL21 (DE3) uden plasmider og kloningstammen E. coli DH5a, som mangler både lacik/p lacUV5-T7 ekspressionssystem og lac operon. Ved at anvende de ovenfor beskrevne pletterings-og strømningscytometriprotokoller fandt vi, at eksacerbationseffekten var beskeden eller fuldstændig fraværende i begge stammer (yderligere fil 1: Fig. S6A, B). Dette antyder, at dobbeltspændingen fra IPTG og TCP kun manifesteres i stammer, der bærer Duetplasmider og det tilsvarende ekspressionssystem.

vi antager, at de studerede rekombinanter ikke effektivt kunne undertrykke dobbeltspændingen fra IPTG og det toksiske substrat på grund af den metaboliske byrde, der pålægges af plasmider og den tilsvarende mangel på ressourcer, der kræves til cellevedligeholdelse. Det ser ud til, at den kemiske struktur af IPTG, dens transport eller tilstedeværelse inde i cellen udløser fysiologiske ændringer, der letter manifestationen af TCP-toksicitet i E. coli BL21(DE3) celler med Duetplasmider.

reduktion af metabolisk byrde og toksicitetsforværring ved at indstille IPTG-koncentration

dernæst forsøgte vi at reducere byrden pålagt E. coli-rekombinanter ved at optimere koncentrationen af IPTG. Vi ledte efter den lavest mulige koncentration af inducer, der ville minimere fitnessomkostningerne uden væsentligt at kompromittere systemets effektivitet ved at nedbryde TCP. Deg31-celler blev præinduceret med IPTG-koncentrationer i området fra 0,01 til 1,00 mM, og de resulterende virkninger på cellelevedygtighed og vejeffektivitet blev undersøgt (Fig. 4; yderligere fil 1: Fig. S7).

E. coli BL21 (DE3) med de tomme pETDuet-og pCDF-plasmider blev anvendt som kontrol til plettering for at vurdere den byrde, der blev pålagt værten ved IPTG-eksponering i fravær af den heterologe vej (Fig. 4). Levedygtigheden af den præinducerede nedbryder og kontrol blev kontrolleret før og efter 5 timers inkubation i phosphatbuffer med 2 mM TCP og sammenlignet med den for celler, der ikke blev udsat for IPTG (Fig. 4a, b). Procentdelen af overlevende celler efter inkubation blev beregnet i hvert tilfælde (Fig. 4c). Disse eksperimenter viste, at selv i fravær af TCP var der en invers korrelation mellem IPTG-koncentrationen og levedygtigheden af den rekombinante E. coli (Fig. 4a). Deg31-stammen led mere af stigende IPTG-koncentrationer end kontrollen, sandsynligvis på grund af den ekstra byrde ved at udtrykke gener, der koder for den syntetiske vej. Det modsatte var tilfældet efter 5 timers inkubation, fordi TCP-kataboliserende deg31-stamme var mere resistent over for forværret toksicitet end værtskontrollen (Fig. 4b, c). Den syntetiske vejstamme udviste lignende overlevelsesrater ved alle testede IPTG-koncentrationer bortset fra den højeste—den relative levedygtighed af deg31 forudinduceret med 1 mM IPTG var 100 %. Vi antog, at denne yderværdi skyldtes undervurdering af antallet af levedygtige celler før inkubation på grund af den intensive stress, som nedbrydes ved induktion med en så høj koncentration af IPTG og den resulterende tilstedeværelse af levedygtige-men-ikke-dyrkbare celler i suspensionen . Plating eksperimenter viste, at en brøkdel af bakteriepopulationen genvandt sin evne til at vokse og reproducere nogen tid efter behandling med denne høje koncentration af IPTG (yderligere fil 1: Fig. S8).

tidskurserne for TCP-biotransformation med hvilende celler af deg31 præinduceret med IPTG ved 1,00, 0,20, 0,05, 0,025 og 0,01 mM (yderligere fil 1: Fig. S7) og densitometrisk analyse af SDS polyacrylamidgeler med de tilsvarende prøver af cellefrie ekstrakter (yderligere fil 1: Fig. S9, tabel S1) viste det: (i) det relative forhold mellem de rekombinante bakteriers og nedbrydningsprofilens form ændrede sig ikke væsentligt med induktorkoncentrationen, mens (ii) indholdet af de tre veje i det samlede opløselige protein af de rekombinante bakterier faldt fra 55% (1 mM IPTG) til 32% (0,01 mM IPTG), og vejens output faldt fra 70 til 46 %. Mærkbar konvertering af TCP blev også opnået med ikke-inducerede celler på grund af lækage af T7-promotoren og basalekspression af gener inden for vejen (yderligere fil 1: Fig. S7).

figur 5 opsummerer balancen mellem de tre parametre, der er diskuteret i de foregående afsnit: (i) værtslevedygtighed, (ii) cellulær ekspression af vejsymer og (iii) output fra den syntetiske bionedbrydningsrute. Vi konkluderer, at den minimale IPTG-koncentration, der tillader tilstrækkelig ekspression af gener inden for vejen til at opnå en rimelig output, er 0,025 mM. lignende inducerkoncentrationer, der tillader fuld genekspression, er rapporteret for enkelt rekombinante proteiner, såsom larr-galactosidase, grønt fluorescerende protein og rhamnulose-1-phosphataldolase . Bemærk, at IPTG-koncentration på 0,025 mM er otte gange lavere end den oprindeligt testede inducerkoncentration og op til 40 gange lavere end de værdier, der er rapporteret i den videnskabelige litteratur, der beskriver konstruktion af heterologe veje i E. coli . Induktion med lavere mængder IPTG forbedrede værtens kondition. Selv den laveste koncentration på 0,01 mM reducerede imidlertid levedygtigheden af E. coli-nedbryderen med 30% i forhold til ikke-induceret deg31 og med op til 50% i forhold til den ikke-inducerede værtskontrol (P < 0,05 i begge tilfælde; Fig. 4b). Vi undersøgte derfor mulighederne for at erstatte IPTG med en alternativ inducer.

reduktion af metabolisk byrde og toksicitetsforværring ved at inducere med lactose

Lactose er en naturlig inducer af lac operon og kan anvendes som et billigere alternativ til syntetisk IPTG. Det har vist sig at inducere ekspression af rekombinante proteiner i E. coli i samme omfang som IPTG på både laboratorie-og industrielle skalaer . I modsætning til IPTG er lactose et substrat af L. coli BL21(DE3) og kan således metaboliseres af celler med en intakt Lac-operon, herunder E. coli BL21 (DE3). Derfor er koncentrationer af lactose op til 30 mM almindeligt anvendt til at inducere ekspressionen af klonede gener på niveauer, der kan opnås med lut1 mM IPTG .

vi undersøgte præinduktionen af deg31-celler med 1 mM lactose. Vi antog, at denne koncentration ville være tilstrækkelig til at inducere ekspressionen af TCP-nedbrydningsvejgenerne på niveauer, der ville give tilstrækkelig nedbrydningseffektivitet. Denne forventning blev bekræftet af registrerede tidskurser for TCP-biotransformation og konstateringen af, at Vej-celler tegnede sig for op til 41% af cellernes samlede opløselige protein under disse betingelser (yderligere fil 1: fig. S7 og S9 og tabel S1). Den teoretiske omdannelse af TCP til glycerol under disse betingelser var 63 %. Disse værdier er tæt på dem, der observeres for deg31-celler, der er præinduceret med 0,025 eller 0,05 mM IPTG. Vigtigst er det, at deg31-cellerne, der var præinduceret med lactose, udviste højere levedygtighed før og efter 5 h inkubation med TCP sammenlignet med bakterier behandlet med IPTG i en hvilken som helst af de testede koncentrationer (P < 0,05; Fig. 4). Den samme lindrende virkning blev observeret for værtskontrollen. Med hensyn til overlevelse udførte cellerne præinduceret med lactose næsten såvel som deres ikke-inducerede modstykker (Fig. 4c). I overensstemmelse med platingsresultaterne afslørede strømningscytometrisk analyse af værtskontrol og deg31-celler, der var præinduceret med lactose, signifikant lavere niveauer af stressede celler med depolariserede membraner, end der blev observeret for E. coli-stammer, der var præinduceret med IPTG (P < 0,01; yderligere fil 1: Fig. S10). Disse resultater indikerede igen, at virkningen af IPTG i de undersøgte rekombinanter konsekvent blev ledsaget af ændringer i membranegenskaber.

en højere levedygtighed af celler induceret med lactose i stedet for IPTG blev tidligere rapporteret for ekspression af enkelt heterologe proteiner . Denne effekt blev tilskrevet den forsinkede, mildere induktion opnået med den naturlige inducer. I modsætning til syntetisk IPTG, som hurtigt kan komme ind i cellen både ved passiv diffusion og ved hjælp af LacY lactosepermease, kan lactose kun komme ind i cytoplasmaet via permease. Desuden skal lactose omdannes til allolactose ved hjælp af Kurt-galactosidase, før den bindes til lac-repressoren, mens IPTG binder direkte til repressoren. Vores resultater bekræfter, at lactose pålægger en lavere metabolisk byrde end IPTG, hvilket tyder på, at det også er en mere egnet inducer til ekspression af hele heterologe veje i E. coli BL21(DE3). Dette er især vigtigt for E. coli BL21(DE3) celler, der bærer syntetiske veje, der nedbryder giftige forbindelser eller producerer giftige mellemprodukter.