Gelfiltreringskromatografi

anvendelse af Gelfiltreringskromatografi

Gelfiltreringskromatografi, en type størrelse ekskluderingskromatografi, kan anvendes til enten fraktionering af molekyler og komplekser i en prøve i fraktioner med et bestemt størrelsesområde for at fjerne alle molekyler, der er større end en bestemt størrelse fra prøven, eller en kombination af begge operationer. Gelfiltreringskromatografi kan bruges til at adskille forbindelser, såsom små molekyler, proteiner, proteinkomplekser, polysaccharider og nukleinsyrer, når de er i vandig opløsning. Når et organisk opløsningsmiddel anvendes som den mobile fase, kaldes processen i stedet gelpermeationskromatografi.

Gelfiltreringskromatografi kan også bruges til:

• fraktionering af molekyler og komplekser inden for et forudbestemt størrelsesområde
• Størrelsesanalyse og bestemmelse
• fjernelse af store proteiner og komplekser
• Bufferudveksling
• afsaltning
• fjernelse af små molekyler såsom nukleotider, primere, farvestoffer og forurenende stoffer
• vurdering af prøvens renhed
• adskillelse af bundet fra ubundne radioisotoper

gelfiltreringskromatografimedier til alle ovennævnte anvendelser er tilgængelige i færdigpakkede tyngdekraftsstrømskolonner, Spinkolonner, lavtryk og mellemtrykskromatografisøjler og flaskeharpikser.

Gelfiltreringskromatografimekanisme

i en gelfiltreringskromatografisøjle er den stationære fase sammensat af en porøs Matrice, og den mobile fase er bufferen, der strømmer ind mellem matricen perler. Perlerne har et defineret porestørrelsesområde, kendt som fraktioneringsområdet. Molekyler og komplekser, der er for store til at komme ind i porerne, forbliver i den mobile fase og bevæger sig gennem søjlen med strømmen af bufferen. Mindre molekyler og komplekser, der er i stand til at bevæge sig ind i porerne, går ind i den stationære fase og bevæger sig gennem gelfiltreringskolonnen ved en længere vej gennem perlernes porer.

ethvert molekyle eller kompleks, der ligger over fraktioneringsområdet for en bestemt gelfiltreringskromatografisøjle, vil bevæge sig gennem søjlen hurtigere end noget molekyle, der kan komme ind i den stationære fase. Derfor vil enhver bestanddel i prøven, der ligger over fraktioneringsområdet, eluere først (i tomrumsvolumen) før noget, der er i fraktioneringsområdet. Den mindste størrelse, der forbliver i den mobile fase og ikke går ind i den stationære fase, er kendt som udelukkelsesgrænsen. Bio – Rad tilbyder gelfiltreringskromatografimedier og kolonner med udelukkelsesgrænser, der spænder over tre størrelsesordener, fra 100 Dalton til 100.000 Dalton (100 kDa).

molekyler og komplekser, der kan komme ind i den stationære fase, vil blive fraktioneret i henhold til deres størrelser. Mindre molekyler vil migrere dybt ind i porerne og vil blive forsinket mere end større molekyler, der ikke så let kommer ind i porerne og således elueres hurtigere fra søjlen. Denne forskel i poremigration fører til fraktionering af komponenter efter størrelse med den største eluering først.

i gelfiltreringskromatografikolonner designet til afsaltning, bufferudveksling og fjernelse af små molekyler, såsom nukleotider, kommer saltene og de små forbindelser let ind i porerne, forsinkes og migrerer langsommere gennem søjlen end de større proteiner eller nukleinsyrer. Derfor elueres komponenterne af interesse i prøven forud for salte, nukleotider osv. DNA-oprydningssæt, der bruger denne mekanisme, indeholder ofte gelfiltreringsspinkolonner.

opløsning, her defineret som skarpheden af grænserne mellem størrelsesfraktioner, bestemmes af perlestørrelse og en række andre faktorer. Mindre perlestørrelse giver generelt højere opløsning i en gelfiltreringskromatografisøjle. Kompakte molekyler diffunderer gennem den stationære fase hurtigere end lineære molekyler. Størrelseseksklusion, fraktioneringsområde og elueringshastighed påvirkes af buffersammensætning, ionstyrke og pH. til fraktionering af komplekse blandinger af proteiner kan det være nødvendigt at bestemme elueringstider og størrelseseksklusionsgrænser empirisk.

Gelfiltreringskromatografimedier

et vigtigt kriterium for gelfiltreringskromatografimedier er, at medier er inerte, og at intet i prøven eller nogen buffer binder til medierne. En anden overvejelse er den type gelfiltreringskolonne, der anvendes, og om den anvendes i et kromatografisystem under tryk eller tyngdekraftstrøm eller spinkolonner. Hvis der anvendes et kromatografisystem under tryk, skal både søjlen og mediet være i stand til at tolerere de anvendte tryk-og strømningshastigheder.

almindeligt anvendte medier til gelfiltreringskromatografi er baseret på agarose-eller polyacrylamidperler, dekstrose til tyngdekrafts-eller lavtrykssystemer og polymerharpikser til mellemtrykssystemer. Valget af medier afhænger af egenskaberne af de komponenter, der skal adskilles, og andre eksperimentelle faktorer. Følgende er generelle overvejelser ved bestemmelse af valget af gelfiltreringskromatografimedier:

• Fraktioneringsområde
• størrelse udelukkelsesgrænse
• driftstryk
• strømningshastighed
• prøveviskositet
• pH-område
• Autoklaverbarhed
• Tolerance for vand-blandbar organiske opløsningsmidler; nogle prøver kan være mere opløselige i en vand-organisk blanding
• tolerance for vaskemidler, chaotrope midler, formamid osv.
• driftstemperatur

typerne af prøver, valg af medier og opsætning af kromatografisystemet bestemmer, hvilke parametre der er de vigtigste for en given rensningsapplikation.