resultater og diskussion
PCR-RFLP-analyse afslørede restriktionsmønstre, der var kompatible med in silico-analyse. Alle hunde med halemisdannelse præsenterede det samme mønster (3 fragmenter, 2 synlige bånd), som var forskellig fra det, der blev præsenteret af hunde med normal hale (2 fragmenter, 1 synligt bånd) (Fig.1). Et andet assay, også baseret på PCR-RFLP, blev med succes anvendt til at identificere den samme mutation i T-genet hos hunde, men ved anvendelse af et polyacrylamidgelelektroforesesystem (Grusscynska & Tsapla 2011). Udførelsen af polyacrylamidgelelektroforese kunne forbedre opløsningen af bånd i forhold til DNA-fragmenter i den foreliggende undersøgelse. Imidlertid vil anvendeligheden blive reduceret, da dette system er mere besværligt. I den foreliggende undersøgelse, selvom det ikke var muligt at visualisere alle DNA-fragmenter genereret efter fordøjelsen, var det let at skelne genotyper ved anvendelse af agarosegelelektroforese.
Fig.1. PCR-RFLP til påvisning af c189g-mutation. Markør af basepar (M), berørte hunde – kort hale (1-7) og dyr med normal hale (8).
i analysen af sekventerede prøver blev heterosygositet C (cytosin) G (guanin) kun observeret i nukleotid 189 af ekson 1 hos hunde med halemisdannelse. Placeringen af mutationen var baseret på t-gen mRNA-sekvensen tilgængelig i Genbanken (tiltrædelsesnummer: AJ245513).
ved in silico-analysen blev der også observeret ændring af aminosyre 63 Fra isoleucin til methionin. Alle DNA-sekvenser opnået i denne undersøgelse blev deponeret i Genbank under tiltrædelsesnumre: MF495488 (kort hale), MF495489 (fravær af hale), MF495490 (fravær af hale) og MF495491 (normal hale).
selvom der kun blev fundet en genotype for den nuværende tilstand (CG for dyr med halemisdannelse), blev der observeret en fænotypisk variation hos berørte hunde, hvilket er halestørrelsen. 3-4 hvirvler), og andre viste fravær af hale (ca.1-2 hvirvler) (Fig.2). Lignende fænotyper blev også observeret af Havert et al. (2001) hunde. Selvom en forklaring på dette endnu ikke er kendt hos hunde, Buckingham et al. (2013), der studerede medfødt halestørrelsesvariation hos katte, fandt tegn på haploinsufficiens forårsaget af flere mutationer i T-genet. C. 1199delc, c.1169delc og c.998delT mutationer var forbundet med forskellige niveauer af genekspression, hvilket kunne forklare de forskellige fænotyper blandt hunde med halemisdannelse (Buckingham et al. 2013).
Fig.2. (A) hund, der bærer mutation C189G i T-genet. B) hund fra samme kuld uden c189g-mutation.
mutationens arvelige karakter kan bevises ved heredogramanalysen (Fig.3) af det studerede kuld. Det var muligt at verificere, at mutationen har et autosomalt dominerende arvemønster. Imidlertid blev der ikke fundet nogen dominerende homosygøs (GG) genotype i denne undersøgelse, hvilket forstærkede observationerne om, at det muterede t-gen forårsager fosterdød, når det er i homosygose. 2001). Hytonen et al. (2009) observerede, at kuld fra kryds mellem normalhalede dyr (CC-genotype) var 29% større end kuld fra krydsning mellem misdannede haledyr (CG-genotype). Dette resultat er kompatibelt med den forventede reduktion på 25% hos afkom fra kryds, der involverer dødelige alleler.
Fig.3. Heredogram, der viser arvemønsteret for C189G-mutationen i T-genet fra Labrador Retriever. Krydsning mellem mødre bedsteforældre (I), kuld af den berørte hund og dens krydsning med normal han (II) og kuld analyseret (III).
mutationer i T-genet har været forbundet med halemisdannelse hos andre arter såsom mus og katte. 1995, Buckingham et al. 2013). Og i nogle af dem observeres også andre ændringer, såsom urin-og fækal inkontinens hos katte (Robinson 1993). Hos hunde er der hidtil kun observeret halemisdannelse hos heterosygøse dyr (CG) (Indrebo et al. 2008). Selvom fænotypen “halemisdannelse” i nogle hundeacer ikke var forbundet med c189g-mutationen (Boston Terrier, engelsk Bulldog, King Charles Spaniel, Miniature Schnauser, Parson Russell Terrier og Rotteveller), antyder det store antal berørte racer en gammel mutation (Hytonen et al. 2009), der er til stede i forfædres hunde før dannelsen af mange racer. Imidlertid, interracial krydsning kan også have bidraget til mutationsdiffusion, da CG heterosygøse dyr ser ud til at have ingen libido eller reproduktive præstationsændringer. En anden faktor, der kan have bidraget til mutationsdiffusion, var brugen til reproduktion af hunde uden hale, da æstetisk caudektomi stadig var tilladt. I denne periode er det sandsynligt, at mange dyr med halegenese er blevet brugt som reproducenter, da halefravær var ønskeligt i nogle racer, hvilket bidrog til mutationsdiffusionen.
i øjeblikket er praksis med caudektomi (kirurgisk fjernelse af hale) en forbudt procedure i flere lande i verden som dem i Den Europæiske Union og Brasilien. 2001, CFMV 2013). I nogle EU-lande anvendes genetiske tests til identifikation af c189g-mutationen i T-genet til at verificere, om fraværet af hale hos nogle racer er af medfødt oprindelse, eller dyrene har gennemgået uregelmæssig kirurgisk procedure. PCR-RFLP anvendt i denne undersøgelse var en enkel og nøjagtig teknik til at identificere denne mutation og kunne bruges som bevis for at identificere ulovlig caudektomi-praksis.
på grund af manglen på information om c189g-mutationen i T-genet hos hunde er der ingen yderligere information om dens tilknytning til andre morfologiske eller endda fysiologiske karakterer og skal derfor undersøges.