Klassisk for at udføre et radioimmunoassay gøres en kendt mængde af et antigen radioaktivt, ofte ved at mærke det med gamma-radioaktive isotoper af jod, såsom 125-i, bundet til tyrosin. Dette radioaktivt mærkede antigen blandes derefter med en kendt mængde antistof for det antigen, og som et resultat binder de to specifikt til hinanden. Derefter tilsættes en prøve af serum fra en patient indeholdende en ukendt mængde af det samme antigen. Dette får det umærkede (eller” kolde”) antigen fra serumet til at konkurrere med det radiomærkede antigen (“varmt”) om antistofbindingssteder. Når koncentrationen af” koldt ” antigen øges, binder mere af det sig til antistoffet, fortrænger den radioaktivt mærkede variant og reducerer forholdet mellem antistofbundet radioaktivt mærket antigen og frit radioaktivt mærket antigen. De bundne antigener adskilles derefter, og radioaktiviteten af det frie(ubundne) antigen, der er tilbage i supernatanten, måles ved hjælp af en gammatæller.
denne metode kan i princippet anvendes til ethvert biologisk molekyle og er ikke begrænset til serumantigener, og det er heller ikke nødvendigt at anvende den indirekte metode til måling af det frie antigen i stedet for direkte måling af det fangede antigen. For eksempel, hvis det er uønsket eller ikke muligt at radiomærke antigenet eller målmolekylet af interesse, kan en RIA udføres, hvis to forskellige antistoffer, der genkender målet, er tilgængelige, og målet er stort nok (f.eks. Det ene antistof ville blive radioaktivt mærket som ovenfor, mens det andet ville forblive umodificeret. RIA ville begynde med, at det “kolde” umærkede antistof fik lov til at interagere og binde til målmolekylet i opløsning. Fortrinsvis immobiliseres dette umærkede antistof på en eller anden måde, såsom koblet til en agarosekugle, belagt til en overflade osv. Dernæst får det” varme ” radiomærkede antistof lov til at interagere med det første antistof-målmolekylekompleks. Efter omfattende vask måles den direkte mængde radioaktivt antistof bundet, og mængden af målmolekyle kvantificeres ved at sammenligne det med en referencemængde analyseret på samme tid. Denne metode svarer i princippet til den ikke-radioaktive Elisa-metode.