the Embryo Project Encyclopedia

Guthrie-testen, også kaldet PKU-testen, er et diagnostisk værktøj totest spædbørn til phenylketonuri et par dage efter fødslen. For at administrere Guthrie-testen bruger læger Guthrie-kort til at indsamle kapillærblod fra et spædbarns hæl, og kortene gemmes til senere test. RobertGuthrie opfandt testen i 1962 i Buffalo. Phenylketonuri (PKU) er en medfødt fødselsabnormalitet, hvor giftige niveauer afaminosyre phenylalanin opbygges i blodet, en proces der påvirkerhjerne hos ubehandlede spædbørn. Guthries test registrerer phenylalanin iblod af nyfødte, der muliggør tidlig diagnose af PKU. Tidligtdiagnoser af PKU forhindrer udviklingen af psykiske handicap itusindvis af personer, der berøres hvert år.

PKU er en arvetmetabolisk sygdom, hvor kroppen ikke producerer hydroksylasen. Phenylalanin bryder nedaminosyre phenylalanin i blodet. Personer med PKU kan ikkefordøje høje koncentrationer af aminosyren phenylalanin. Højkoncentrationer af phenylalanin er til stede i proteinrige fødevarer, sådansom kød og fisk såvel som i sødestoffet aspartam. Når enkeltpersoner med PKU undlader at fordøje phenylalaninen i fødevarer, de forbruger, høje niveauer af phenylalanin opbygges i blodet, forårsagerhjerne skade. Derfor skal personer med PKU spise alvorligtbegrænsede kostvaner for at undgå at indtage fødevarer med høje koncentrationer afphenylalanin. Ubehandlet PKU kan føre til psykiske handicap, hjerneskader og anfald. PKU påvirker cirka en ud af 15.000 mennesker i USA årligt.

før oprettelsen af Guthrie-testen, lægetestede spædbørn til PKU med en mindre pålidelig jernchloridurintest.Ferrichloridurintesten påviste tilstedeværelsen af phenoler,inklusive phenylpyruvat, i urinen. Tilstedeværelsen af phenolphenylpyruvat i urinen indikerede, at individet ikke kunne fordøje phenylalanin, fordi phenylpyruvat er et derivat af phenylalanin.For at udføre en urinprøve af jernchlorid opløste en læge en urinprøve i en opløsning af vand, ethanol og et par dråber jernchlorid. Hvis phenylpyruvat var til stede i prøven, dannede det enkompleks med jernchloridet og producerede en intens blågrønfarve, hvilket indikerer, at patienten havde PKU. Læger noterede flereproblemer med ferrichlorid urintest, inkluderet, at det mislykkedes at producere et positivt testresultat med phenylalanin niveauer under 20milligram pr 100 milliliter. En sådan test havde begrænset følsomhed, og praktikere kunne let gå glip af lavere koncentrationer af phenylalaninniveauer hos personer med PKU. Som følge heraf kæmper lægerne for atdiagnosticere og behandle de personer med PKU, hvis urinprøver indeholdt lave niveauer af phenylalanin, hvilket førte til irreversible hjerneskader. Mange spædbørn testet med ferrichlorid urintest mislykkedesat teste positivt for PKU i de første seks til otte uger efter fødslen.Beviserne viste imidlertid, at phenylalaninniveauerne i blodet stiger hurtigt i de første par dage af livet, hvilket muligvis fører til toneurologisk skade i denne periode. På grund af unøjagtigheden af ferrichlorid urintest, mange spædbørn med PKU gik udiagnosticeretog udviklede symptomer, der varede i hele deres liv.

i 1957 bad lægen Robert Varner ved Children ‘ s Rehabilitation Center inBuffalo Guthrie om at udvikle en mere pålidelig og hurtig metode til at opdage PKU end den,der var tilgængelig på det tidspunkt. Guthries PKU-forskning gennem deres fælles tilknytning til theErie County National Association of Retarded Children i Buffalo. Han bad Guthrie om at skabe en mere bekvem måde at teste for PKU på, fordi lægerne på det tidspunkt for at bekræfte en positiv jernchloridtest måtte sende halvtreds til tyve kubikcentimeter (cc) venøst blod til en testsite i Californien for at teste hver patient. Laboratorieteknikere på teststedet udførte derefter en blodprøve for at bekræfte eller afkræfte tilstedeværelsen af høje niveauer af phenylalanin i blodet. Guthrie udviklede en nytest for varsler et par dage efter den oprindelige anmodning. Testen Guthrieudvikled brugte en bakteriel inhiberingsanalyse til at detektere phenylalanin.

bakteriehæmmende analyser er tests, hvor forskere bruger bakterierat måle koncentrationen af et stof i en prøve.L-2-Thienylalanin, en aminosyre, hæmmer væksten af bakterienabacillus subtilis. Guthrie fandt ud af, at phenylalanin, et kemikalie, der blev fundet iblodet af mennesker med PKU, reverserede karrus-2-Thienylalanins hæmning af B. subtilis vækst. Således at udføre en PKU inhibering bakterielassay, Guthrie coatede en gel, der blev brugt til at dyrke bakterier med Kurt-2-Thienylalanin. Guthrie placerede derefter blodprøver, tørret på tyktfilterpapir, på den gel. Hvis blodprøven indeholdtphenylalanin, B. subtilis voksede omkring blodprøven og indikerededen patient havde PKU. Hvis blodprøven ikke indeholdtphenylalanin, B. subtilis voksede ikke omkring blodprøven,hvilket indikerer, at patienten ikke havde PKU. Guthrie bemærkede, at asingle-tekniker kunne teste en til 200 blodprøver på en enkelt dag, og at hver test kun krævede en fingerprik af kapillærblod på enfilterpapirskive.

efter at have udviklet testen og vist den til Varner,testede Guthrie følsomheden af hans bakteriehæmningsassay ved hjælp afnormale blodprøver tilsat phenylalanin. Følsomhed erevnen af en test til at opdage alle tilfælde, hvor sygdommen er til stede.Guthrie tilføjede 2, 4, 8, 12 og 20 milligram L-phenylalanin pr.100milligram af blodserum til normale blodprøver for at efterligne niveauerne afphenylalanin fundet hos patienter ramt af PKU. Han inkuberede demtørrede blodprøver med den tilsatte L-phenylalanin natten over på de bakterielle inhiberingsanalyser og fandt ud af, at bakterier var vokset omkring papirskiver. Han fastslog, at bakterievækst spikede i prøverneindeholder 12 og 20 milligram phenylalanin pr.100 milligram afserum, hvilket betyder, at disse prøver angav en person muligvis hadPKU og skulle gennemgå yderligere blodprøvning.

efter at have evalueret sin test i laboratoriet sammenlignede Guthrie resultaterne af sin test og af ferrichloridurintesten på 3.118 prøver fra Nyark State School ivark, Ny York. Derefter bekræftede Guthrie alle positive tilfælde bestemt ved Guthrie-testen og jernchloridurintesten med et kvantitativt blodassay. Han sammenlignede resultaterne af Guthrie-testen med resultaterne af ferrichloridurintesten og deres følsomheder til påvisning af sygdommen nøjagtigt. Guthrie fandt ud af, at hans test opdagede enogtyvepositive tilfælde af PKU, der også blev bekræftet af det kvantitative blodassay, og jernchloridurintesten opdagede kun sytten af disse tilfælde, hvilket betyder, at jernchloridurintesten ikke kunne opdage fire tilfælde af PKU. Ifølge Guthrie antydede disse data, at hans test kunne bruges til at opdage nye tilfælde af PKU i befolkningerallerede screenet ved hjælp af ferrichlorid urintest.

Guthrie såraffineret sin metode ved at gøre blodopsamlingen mere bekvem forlæger. Hvis læger diagnosticerede patienter tidligere, kunne patienterne gennemføreen proteinbegrænset diæt, før aminosyren phenylalanin steg tiltoksiske niveauer i blodet og forårsagede irreversibel neurologisk skade.Efter hans tests første succes ændrede Guthrie sin bacterialinhibition assay, så spædbørn kunne testes et par dage efter birth.To gør det, Guthrie bestemte, om en lille samling af kapillært blod fra et spædbarns hæl ville arbejde på bakterieinhibitionsanalysen. Han lavede kort, senere kaldet Guthrie-kort, som var tykke filterpapir, hver med et metalblad, der punkterede et spædbarns skind og opsamlede det resulterende blod. Han lod blodet tørre direkte påkortet og gemte det til test. Fra kortet slog han derefter hul rundt om papirskiven af blodet, der skulle placeres senere på agar gelculture. Guthrie fandt ud af, at bakteriehæmningsanalysen arbejdede medspædbarns hælblod.

efter Guthrie ‘ s udvikling af sin PKU-test begyndte National Association of Retarded borgere i Ny York City,Nyork, at støtte brugen af Guthrie-testen og valgte to søstre, der havde PKU som deres plakatbørn til en indsats fra 1961 for at offentliggøre testen. Den ældre søster, Sheila McGrath, havde mentalhandicap og blev diagnosticeret med PKU senere i livet. Youngersøster, Kammy McGrath, blev diagnosticeret med PKU ved Guthrie-testen og behandlet tidligt i sit liv og dermed undgå psykiske handicap. I efteråret 1961 offentliggjorde National Association of Retarded borgere Guthrie-testen på deres pressekonference i San Francisco, Californien,og Life-magasinet offentliggjorde en artikel om Guthrie og hans nyfødte skærmdet følgende år.

også i 1961 finansierede det amerikanske Børnebureau Guthrie til at teste Guthrie-testen hos 400.000 spædbørn. Guthrie og hans team testede 404.568 spædbørn for PKU ved hjælp af Guthrie-testen og urinprøven med jernchlorid. Guthrie og hans holddiagnosticeret syvogtredive tilfælde af PKU om to år. Guthrie ‘ s testidentificerede 275 spædbørn som formodede positive for PKU, hvilket betyder, at de sandsynligvis ville have PKU. Af de 275 spædbørn, der formodes at være positive for PKU,blev syvogtredive tilfælde af PKU bekræftet ved at gentage Guthrie-testenog ved hjælp af en kvantitativ blodanalyse, hvilket betyder, at testen var effektiv.

i 1962 indgik Guthrie en kontrakt med Ames Company i Elkhart, Indiana, en division af Miles Laboratories,om at producere og markedsføre Guthrie testkits til hospitaler. Ames-selskabet fastsatte dog, at de kun ville væreIndtast en kontrakt, hvis testen modtog et patent. Guthrie indgav apatent på Guthrie-testen i sit eget navn i 1962. Han underskrev derefter en eksklusiv licensaftale med Ames Company. Licensaftalen gav Guthrie ingen royalties, hvilket betyder, at Guthrie ikke ville tjene nogen penge på de solgte testsæt. Fem procent af nettoprovenuet fra testen blev delt mellem National Association for Retarded borgernes Forskningsfond, Association for Aid of Crippled Children i Ny York og University of Buffalo Foundation i Buffalo, Nyork. Guthrie fastsatte ikke, hvilken pris sætene skulle sælges til ikontrakten.

efter underskrivelsen af kontrakten kæmpede Ames Company for atproducere nok testsæt til at imødekomme efterspørgslen. Guthrie hjalp med at producere testkits og opnåede økonomisk støtte fra US Children ‘ s Bureau til at producere og samle sæt til at udføre 500 tests i et lejet hus i Buffalo, NY York. Guthries sæt sælges for $ 6 hver. I 1963 Guthrielærte, at Ames Company planlagde at opkræve $262 hver for det samme PKUtest kit. Ifølge biograf Jean Koch krævede Guthrie prisenvære sænket. Guthrie spurgte Russell B. Long, en amerikansk Senator fra Louisiana,for at undersøge sagen for at se, om Ames-selskabet havde fuld juridisk kontrol over prisen på testsættene.

Senator Long rapporterede, Atus Public Health Service, en afdeling af det amerikanske Sundhedsministeriumhovedkvarteret i DC, havde ikke godkendt Guthrie ‘ s aftale med det private Ames-selskab. Imidlertid havde to frivillige sundhedsforeninger og Children ‘ s Hospital of Buffalo støttet aftalen, så Ames-selskabet havde fuld kontrol over prisen. Ifølge forsker Diane B. Paul, Guthrie beklagede dybt ikke at medtage aprice-bestemmelse i kontrakten. Ames company frigav derefter en erklæring om, at der ikke blev solgt kits til $262, og at tusinder af dollars af Proceedings blev brugt til at dække udgifterne til byggeproduktionsfaciliteter til Guthrie testkits. Virksomheden solgte testsæt somkunne teste for 325 spædbørn for $67,71 hver.

efter at have fundet et firma til at fremstille sine tests, kæmpede Guthrie for at få hospitaler til at implementere testen og medicinske tidsskrifter for at offentliggøre sine forsøgsresultater. Guthrie ogForældre til børn med PKU pressede lovgivere til at give mandat til nyfødtscreening af PKU i enhver stat. I 1963 mandaterede Massachusetts nyfødtescreening for PKU. Året offentliggjorde Guthrie nogle af hans resultateri et fagfællebedømt tidsskrift. Guthrie kæmpede derefter på tværs af mange stater og lande og holdt taler og foredrag på konferencer for at tilskynde regeringerne til at give mandat til Guthrie-testen. I 1966 var Guthrie-testenobligatorisk i de fleste amerikanske stater.

efter 1960 ‘ erne betalte forskere mereopmærksomhed på PKU. I 1990 indkaldte forskere over hele verden tildiskutere spørgsmål og fremskridt inden for diagnose og behandling af PKU inParis, Frankrig. Senere samme år gennemførte en gruppe forskere ledet af Yoshiyukiokano i Houston en mutationsanalyse af PAH-genet, som er ansvarlig for produktionen af phenylalaninhydroksylasen. Denne gruppe forskere oprettede også en database for Pahgenmutationer. PAH-databasen førte til dokumentation af mere end340 genmutationer, der kan forårsage PKU. Også i 1990 ‘ erne udviklede amerikanske forskeredonald Chase, David Millington, Naoto Terada, Stephen Kahler, CharlesRoe og Lindsay Hofman en ny teknik til at teste for PKU ved hjælp aftandem massespektrometri. Forskere bruger tandem massespektrometri tilseparate ioner baseret på deres ladning-til-masse-forhold for at detektere PKU i blodprøver. Tandem massespektrometri, som den oprindelige Guthrie test, brugeren hulpunch af tørret blod. Det kan dog screene for en bredere sortaf medfødte sygdomme ved hjælp af en prøve.

i det enogtyvende århundrede krævede alle halvtreds Amerikanske Stater hospitaler at teste nyfødte for PKU,ogguthrie-testen blev brugt mange steder i hele verden. Læger imindre økonomisk udviklede områder brugte Guthrie-testen til at diagnosticerespædbørn med PKU. Men i det enogtyvende århundrede, mange hospitalerbrugt tandem massespektrometri, som kan screene for en bredere vifte afmedfødte sygdomme end Guthrie testen. Begge metoder bruger stadigguthrie-kort til at opbevare det tørrede blod fra spædbørn til test.