2-D elektroforese begynder med elektroforese i den første dimension og adskiller derefter molekylerne vinkelret fra den første for at skabe et elektroferogram i den anden dimension. I elektroforese i den første dimension adskilles molekyler lineært i henhold til deres isoelektriske punkt. I den anden dimension adskilles molekylerne derefter ved 90 grader fra det første elektroferogram i henhold til molekylvægt. Da det er usandsynligt, at to molekyler vil være ens i to forskellige egenskaber, adskilles molekyler mere effektivt i 2-D elektroforese end i 1-D elektroforese.
de to dimensioner, som proteiner adskilles i ved hjælp af denne teknik, kan være isoelektrisk punkt, proteinkompleksmasse i den oprindelige tilstand eller proteinmasse.
adskillelse af proteinerne ved isoelektrisk punkt kaldes isoelektrisk fokusering (IEF). Derved påføres en pH-gradient på en gel, og der påføres et elektrisk potentiale på tværs af gelen, hvilket gør den ene ende mere positiv end den anden. Ved alle andre pH-værdier end deres isoelektriske punkt vil proteiner blive opladet. Hvis de er positivt ladede, trækkes de mod den mere negative ende af gelen, og hvis de er negativt ladede, trækkes de til den mere positive ende af gelen. Proteinerne, der påføres i den første dimension, bevæger sig langs gelen og akkumuleres ved deres isoelektriske punkt; det vil sige det punkt, hvor den samlede ladning på proteinet er 0 (en neutral ladning).
til analyse af proteinernes funktion i en celle er kendskabet til deres samarbejde afgørende. Oftest virker proteiner sammen i komplekser for at være fuldt funktionelle. Analysen af denne suborganelle organisation af cellen kræver teknikker, der bevarer proteinkompleksernes oprindelige tilstand. I nativ polyacrylamidgelelektroforese (native PAGE) forbliver proteiner i deres native tilstand og adskilles i det elektriske felt efter henholdsvis deres masse og massen af deres komplekser. For at opnå en adskillelse efter størrelse og ikke ved nettoladning, som i IEF, overføres en ekstra afgift til proteinerne ved anvendelse af Coomassie Brilliant Blue eller lithium dodecylsulfat. Efter afslutningen af den første dimension ødelægges komplekserne ved at anvende DENATURERINGS-SDS-siden i den anden dimension, hvor proteinerne, som komplekserne er sammensat af, adskilles af deres masse.
før proteinerne adskilles efter masse, behandles de med natriumdodecylsulfat (SDS) sammen med andre reagenser (SDS-side i 1-d). Dette denaturerer proteinerne (det vil sige, det udfolder dem i lange, lige molekyler) og binder et antal SDS-molekyler, der er omtrent proportionale med proteinets længde. Fordi et proteins længde (når den udfoldes) er omtrent proportional med dets masse, svarer dette til at sige, at det binder et antal SDS-molekyler, der er omtrent proportionalt med proteinets masse. Da SDS-molekylerne er negativt ladede, er resultatet af dette, at alle proteinerne vil have omtrent det samme masse-til-ladningsforhold som hinanden. Derudover vil proteiner ikke migrere, når de ikke har nogen ladning (et resultat af det isoelektriske fokuseringstrin), hvorfor belægningen af proteinet i SDS (negativt ladet) tillader migrering af proteinerne i den anden dimension (SDS-side, det er ikke kompatibelt til brug i den første dimension, da det oplades, og der skal anvendes et ikke-ionisk eller vitterionisk rengøringsmiddel).i den anden dimension anvendes et elektrisk potentiale igen, men i en 90 graders vinkel fra det første felt. Proteinerne vil blive tiltrukket af den mere positive side af gelen (fordi SDS er negativt ladet) proportionalt med deres masse-til-ladningsforhold. Som tidligere forklaret vil dette forhold være næsten det samme for alle proteiner. Proteinernes fremskridt vil blive bremset af friktionskræfter. Gelen fungerer derfor som en molekylsigte, når strømmen påføres, idet proteinerne adskilles på basis af deres molekylvægt med større proteiner, der tilbageholdes højere i gelen, og mindre proteiner er i stand til at passere gennem sigten og nå nedre områder af gelen.