1 Introduktion
gener for transmembranproteiner (tmp ‘er) udgør 20-30% af de fleste genomer (Vægin & Heijne, 1998), og baseret på deres kritiske roller i cellefysiologi er tmp’ er målene for en stor brøkdel af klinisk nyttige lægemidler. Bestemmelsen af deres strukturer og handlingsmåder er således af stor betydning. Antallet af tilgængelige tmp-strukturer med høj opløsning forbliver imidlertid relativt lavt (se Stephen Hvid ‘ S hjemmeside; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). To forklaringer, der ofte påberåbes for vanskeligheden ved at opnå veldiffrakterende krystaller af TMP ‘er til brug i Røntgendiffraktionsundersøgelser, er (1) tmp’ er er strukturelt dynamiske med fleksible regioner, der gør det vanskeligt for proteinet at vedtage den ensartede konformation, der kræves til pakning i en krystal; og (2) overflader af transmembrane regioner af TMP ‘ er deltager ikke så let som overfladerne af globulære opløselige proteiner i protein-proteininteraktioner, der kræves til krystalpakning. Introduktion af et stabilt opløseligt protein i et overfladeeksponeret område af en TMP giver en måde at potentielt omgå begge disse problemer, da en sådan indsættelse på et internt sted i en TMP kan reducere den samlede fleksibilitet, og da tilstedeværelsen af et let krystalliserbart opløseligt domæne kan tilvejebringe intermolekylære kontakter, der kræves til krystallisation (Chun et al., 2012; Engel, Chen, & Privrir, 2002).
Fusion af T4-lysosym (T4L) på interne steder i TMPs har hidtil givet en vellykket tilgang til bestemmelse af strukturer for forskellige medlemmer af den vigtige GPCR-superfamilie (Cheresov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Fenalti et al., 2014; Granier et al., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola et al., 2008; Kruse Et Al., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Mads et al., 2013; Jørgen et al., 2013; Hvid et al., 2012; vu et al., 2010, 2012; Et al., 2011; Chang et al., 2012). Lignende interne fusioner af et termisk stabiliseret apocytokrom b (vacker et al., 2013; Jørgen et al., 2013; Jang, Jang, Gao, Paoletta et al., 2014; Chang, Chang, Gao, Chang, et al., 2014) og rubredoksin (Tan et al., 2013) har også givet GPCR strukturer. Derudover er der opnået adskillige GPCR-strukturer ved krystallisation af konstruktioner, hvori den stabiliserende proteinpartner blev smeltet sammen ved N-terminalen af receptorsekvensen snarere end ved en indre position (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thompson et al., 2012; vu et al., 2014), hvilket antyder, at fusionsproteins rolle i lettelse af dannelsen af intermolekylære kontakter kan være vigtigere for at fremme krystallisation end reduktionen af TMP-fleksibilitet. Alternative tilgange til opnåelse af GPCR-strukturer, der ikke involverer anvendelse af fusionsproteiner, har inkluderet cocrystallisering med anti-receptor antistoffer (Kruse Et Al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et al., 2013) og krystallisering af GPCR-varianter, der er blevet termostabiliseret ved introduktion af punktmutationer og sletninger (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). Faktisk har de fleste fusionsproteinholdige GPCR-varianter, der anvendes til vellykket strukturbestemmelse, også inkorporeret punktmutationer og trunkeringer designet til yderligere at forbedre proteinstabiliteten og reducere fleksibiliteten.
indsættelse af stabile opløselige proteiner i tmp ‘er med det formål at fremme krystallisation er generelt blevet udført som en indsættelse eller erstatning for rester i den tredje intracellulære (IC3) sløjfe af GPCR’ er. Dette er baseret på forventningen om, at denne region i receptorer er fleksibel og kan kontrollere den relative bevægelse af omgivende helices (Rosenbaum et al., 2007), samt reducere sandsynligheden for, at indsættelse af fusionspartneren vil forstyrre den samlede GPCR-struktur (Chun et al., 2012). Mens sådanne indsættelser ofte ikke forstyrrer de overordnede strukturer af receptorer (baseret på tilbageholdelse af i det mindste en vis ligandbindende affinitet ved fusionskonstruktionerne), resulterer de generelt i tab af evnen til at aktivere det beslægtede trimeriske g-protein (Rosenbaum et al., 2007), hvilket ikke er overraskende, da IC3-sløjfen ofte er stedet for funktionelle interaktioner mellem GPCR ‘ er og de trimeriske g-proteiner, der er deres umiddelbare nedstrøms effektorer. Desuden er kriterierne for etablering af særlige knudepunkter til indsættelse af fusionsproteiner og til bestemmelse af mængden af receptorsekvens, som de erstatter, ikke veletablerede. En vellykket fusion skal give et optimalt match mellem afstanden og orienteringen af N – og C-termini for det indsatte protein og knudepunkterne i GPCR (Chun et al., 2012; Engel et al., 2002). Således kan oprettelse af en nyttig fusion kræve syntese eller konstruktion af flere versioner af smeltede gener (Rosenbaum et al., 2007).
vi beskriver her en strategi til generering og screening af et bibliotek med variantformer af en receptor indeholdende indsættelser af T4L på forskellige punkter i den tredje intracellulære (IC3) sløjfe som erstatning for forskellige antal aminosyrerester i sløjfesekvensen (Matha, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Ved at udtrykke receptorer i gær er det muligt at oprette randomiserede biblioteker af varianter med lysosymindsættelser og direkte screene for konstruktioner med maksimale samlede ekspressionsniveauer, antal ligandbindingssteder ved celleoverfladen og endda receptorfunktion, analyseret baseret på aktivering af det beslægtede G-protein. Fremgangsmåderne var vellykkede med at identificere receptorer med indsættelser i IC3-sløjfen, der bevarer næsten fuld signalfunktion. Dette antyder, at når T4L-molekylet fastgøres via passende bindingssekvenser, kan det indsættes i denne sløjfe uden at forhindre adgang af G-proteinet til relevante overflader af den aktiverede receptor.
de beskrevne protokoller blev udviklet under anvendelse af Ste2p, en endogen GPCR af gær Saccharomyces cerevisiae anvendt som et tractable initialsystem, for hvilket der endnu ikke er nogen tredimensionel struktur tilgængelig. Imidlertid kunne lignende tilgange bruges til at identificere indsættelsesholdige varianter af de mange pattedyrs GPCR ‘ er, der er rapporteret at være i stand til at aktivere gærferomonresponsvejen (Brun Et al., 2000; dyvel & brun, 2009; Konge, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkovits, 1990; Pausch, 1997) eller til andre tmp ‘ er, som det er muligt at analysere for funktion i intakte celler. Desuden er gærarter blevet anvendt som ekspressionssystemer til strukturbestemmelse af GPCR ‘er og andre tmp’ er (Clark et al., 2010), herunder til bestemmelse af krystalstrukturen af den humane H1-histaminreceptor (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p er receptoren for gærparring feromon-Kurt-faktor, et 13-restpeptid. Binding af denne ligand resulterer i aktivering af et cytoplasmatisk heterotrimerisk G-protein, som igen aktiverer en MAP-kinasevej, hvilket i sidste ende fører til transkriptionelle reaktioner, ændringer i celleform, cellecyklusstop og fusion med gærceller af den modsatte parringstype.