Aktivität und Spezifität
DPP8 und DPP9 weisen eine sehr ähnliche Substrat- und Inhibitorspezifität auf. Da viele der bisher verwendeten DPPIV-Inhibitoren auch DPP8 und DPP9 zu hemmen scheinen, ist es möglich, dass diese Enzyme für einige der Funktionen verantwortlich sind, die DPPIV zugeschrieben werden.
Wie DPPIV und DPP8 bevorzugt DPP9 Pro an der P1-Position von synthetischen Substraten . Wenn Pro an P1 fixiert ist, (X-Pro-NHPhNO2) sind die von DPP9 (und DPP8) an der P2-Position am meisten bevorzugten Reste hydrophobe und basische Reste, und die am wenigsten bevorzugten sind saure Reste (Arg / Met / Leu / Lys > >Ala / Ser / Gly> > Glu / Asp / Asn). Die meisten bisher verfügbaren Daten deuten darauf hin, dass das basische Arg-Pro-NHPhNO2 in Bezug auf die Affinität ein bevorzugtes Substrat ist. Die Fluktuationsrate ist dagegen im Vergleich zu Ala-Pro- und Gly-Pro-NHPhNO2 viel langsamer . Dies steht im Gegensatz zu der viel weniger diskriminierenden Substratspezifität von DPPIV. Die Spaltung von Val-Ala-NHPhNO2 durch DPP9892aa war weniger effizient als die Substrate mit Pro an P1 und Gly-Gly-, Ala-Ala- und Ala-Phe-NHPhNO2 wurden nicht hydrolysiert.
DPP9 hydrolysierte die fluorogenen Substrate Ala-Pro-7-amino-3-trifluormethylcumarin (-AFC) und Ala-Pro-, Gly-Pro-, Lys-Pro-, Trp-Pro-, Val-Pro- und Asp-Pro-AMC. Was die chromogenen NHPhNO2-Substrate betrifft, so war Asp-Pro-AMC das am wenigsten bevorzugte Substrat für DPP9 in dieser Serie.
DPP8 und DPP9 zeigen eine sehr ähnliche Michaelis-Menten-Kinetik. Die katalytischen Wirkungsgrade gegenüber ihren Substraten sind jedoch im Allgemeinen niedriger als die von DPPIV. Beim Vergleich von Literaturdaten zu katalytischen Parametern beobachtet man mehr Diskrepanzen zwischen den verschiedenen Studien für DPP8 und DPP9 als für DPPIV. Aufgrund der breiten Verfügbarkeit werden die Ala-Pro- und Gly-Pro-haltigen chromogenen und fluorogenen Substrate am häufigsten zur Bestimmung der DPP9-Aktivität verwendet. In biologischen Proben ist es obligatorisch, einen spezifischen DPPIV-Inhibitor einzuschließen, um Interferenzen durch DPPIV in den Assays zu eliminieren .
Unter Verwendung von Ala-Phe-Pro-NHPhNO2, Ala-Ala-Pro-NHPhNO2, Ala-Ala-Ala-NHPhNO2 und Z-Gly-Pro-NHPhNO2 als Substrate fehlt rDPP9 Tripeptidase- und Endopeptidaseaktivität. Die Depletion von DPP8 oder DPP9 in Zellen mit siRNA hatte keinen Einfluss auf die Spaltung von Arg-, Ala-Ala-Phe- und Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC . Die maximale DPP9-Aktivität auf von Dipeptiden abgeleiteten chromogenen und fluorogenen Substraten wurde im pH–Bereich pH 7,4-8,5 beobachtet. Unterhalb pH 6,3-6,5 wurde eine geringe Aktivität von rekombinantem und natürlichem DPP9 nachgewiesen. Das neutrale pH-Optimum unterstützt die zytoplasmatische Lokalisation.
Einige Inhibitoren, die ursprünglich für DPPIV entwickelt wurden, hemmen auch die DPP8 / 9-Aktivität. Boronsäurepeptide, einschließlich Val-boroPro, auch bekannt als Talabostat, erwiesen sich als potente Inhibitoren einer Vielzahl von prolinselektiven Proteasen vom Serintyp (DPPII, DPPIV, DPP8, DPP9 und FAP) . Allo-Isoleucylthiazolidin, Lys(Z-(NO2)) Pyrrolidin und Lys (Z-(NO2)) thiazolidin waren gegenüber DPP8 / 9 gegenüber DPPIV etwas selektiver. Eine Reihe α-aminoacyl-((2S,4S)-4-azido-2-cyanopyrrolidine) ergab Mittel mit Ki-Werten im nanomolaren Bereich für DPP8/9 und in einer bescheidenen Gesamtselektivität zu DPPIV und zu DPPII.
Die Substitution des Thiazolidinrings von Allo-Isoleucylthiazolidin durch einen Isoindolinrest verstärkte die DPP8- und DPP9-Hemmung, während die DPPIV-Hemmung signifikant verringert war . Jiaang et al. entdeckte selektive DPP8 / 9-Inhibitoren, die ein Isoindolin an P1 enthalten. Isoindolin mit einem 1-(4,4′-difluorbenzhydryl)piperazin an der P2-Stelle (1G244; PTX1210) ist ein sehr potenter und selektiver DPP8/9-Inhibitor. 1G244 hat IC50-Werte von 14 und 53 nM gegen DPP8 und DPP9. Mit IC50-Werten größer als 100 µM kann man schließen, dass 1G244 DPPIV, FAP oder DPPII nicht signifikant inhibiert. Interessanterweise ist es ein langsam bindender kompetitiver Inhibitor von DPP8, aber die Verbindung verhält sich als kompetitiver und reversibler Inhibitor von DPP9 . Im Gegensatz zu Allo-Ile-Isoindolin durchdrang 1G244 die Plasmamembran und verursachte bei Ratten keine signifikanten toxikologischen Symptome . In einer anderen Reihe von Isoindolin-mimetika zeigte die Verbindung (2S, 3R) -2-amino-1- (5-fluoroisoindolin-2-yl) -3-methylpentan-1-on das beste Gleichgewicht zwischen Wirksamkeit und Selektivität. Obwohl sein Hemmpotential gegenüber DPP8 dem der Elternstruktur ähnlich war, gab es einen bescheidenen, vierfachen Anstieg der Potenz gegenüber DPP9 im Vergleich zu DPP8 . Bisher wurden keine Inhibitoren berichtet, deren Affinität zu DPP8 und DPP9 sich mehr als verzehnfacht.
Durch Beibehaltung der Dipeptid-basierten Struktur und Einführung einer Diarylphosphonat-Einheit in der P1-Position wurden irreversible DPP8 / 9-Inhibitoren entwickelt. Bis(4-acetamidophenyl)pyrrolidin-2-yl- und isoindolin-1-yl-derivate mit einem zweibasischen P2-lysinrest waren potente Inhibitoren für DPP8/9. Eine Reihe von Isoindolin-abgeleiteten Inhibitoren dieser Serie zeigte eine gute Affinität und ausgeprägte Selektivität für DPP8 und DPP9 in Bezug auf DPPIV und DPPII .