Exazerbation der Substrattoxizität durch IPTG in Escherichia coli BL21(DE3), die einen synthetischen Stoffwechselweg trägt

Biotransformation von TCP durch ruhende E. coli BL21(DE3) -Zellen, die Varianten eines synthetischen Abbauwegs tragen

Varianten des synthetischen Weges mit entweder dem Wildtyp-Haloalkan dehalogenase oder die 26-fach katalytisch effizientere Mutante DhaA31 wurden in E. coli BL21(DE3) eingeführt. Dieser Wirt wurde ausgewählt, weil weder die Enzyme noch die Metaboliten des TCP-Signalwegs natürlicherweise in seinem metabolischen Netzwerk vorkommen und wegen des breiten Repertoires kommerziell verfügbarer Duet-Vektoren für diesen Stamm, die die abstimmbare Koexpression mehrerer Gene in einer einzigen Zelle ermöglichen . Dies führte zur Konstruktion eines flexiblen Systems mit begrenztem Risiko für metabolisches Übersprechen, in dem die Expression der drei Signalwegkomponenten orthogonal manipuliert werden konnte . Drei zuvor konstruierte E. die BL21(DE3) Degrader degWT, deg31 und deg31opt wurden getestet (Tabelle 1). E. coli degWT trägt eine Variante des TCP-Weges basierend auf dem Wildtyp-DhaA zusammen mit HheC und EchA, ausgedrückt in einem relativen Verhältnis von 0,24:0,36:0,40, bestimmt nach Präinduktion mit 0,2 mM IPTG (Zusätzliche Datei 1: Abb. S1). Die Stämme deg31 und deg31opt tragen beide den TCP-Signalweg mit der technischen Dehalogenase DhaA31, aber das relative Verhältnis der drei Enzyme in deg31 beträgt 0,14: 0,41: 0,45, während es in deg31opt 0,63: 0,16: 0,21 beträgt. Experimente mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zeigten, dass die drei Enzyme zusammen einen ähnlichen Anteil an der gesamten löslichen Proteinfraktion ausmachten, die von allen drei Degradern produziert wurde: 52% für degWT, 54% für deg31 und 44% für deg31opt.

Vorinduziert (0.2 mM IPTG) ruhende Zellen jedes der rekombinanten Stämme und eine Wirtskontrolle (Tabelle 1) wurden in Phosphatpuffer mit 2 mM TCP inkubiert und die Zeitverläufe der TCP-Biotransformation über ein 5 h Intervall aufgezeichnet (Fig. 1). Die Reaktionsprofile zeigten grundlegende Unterschiede zwischen den Stämmen in Bezug auf die Anfangsraten der TCP-Dehalogenierung, die Akkumulation von Zwischenprodukten und die Gesamteffizienz der Glycerinbildung. Die theoretischen Konzentrationen von Glycerin, sonst schnell von E verwendet. coli, konnte aus den experimentellen Konzentrationen von TCP und detektierten Intermediaten aufgrund der orthogonalen Natur des Pfades berechnet werden . Während deg31opt vom schnellsten ersten Schritt profitierte (Abb. 1d) war der am besten ausbalancierte Weg mit der höchsten Glycerinproduktion deg31 (Abb. 1c). Auf der anderen Seite litt degWT unter einer langsamen TCP-Konvertierung (Abb. 1b), längerer Exposition gegenüber dem toxischen Substrat und unzureichender Signalwegleistung. Erwartungsgemäß wird die Wirtssteuerung (mit den entsprechenden Leerplasmiden, Fig. 1a) zeigte im geschlossenen Batch-System keine Aktivität gegenüber TCP.

Die drei E. coli-Rekombinanten und der Kontrollstamm auf dem Syntheseweg stellen ein geeignetes Modellsystem dar, um den Beitrag der metabolischen Belastung und der Substrat- / Metabolitentoxizität zu den Fitnesskosten der TCP-Biotransformation durch Ganzzellkatalysatoren zu untersuchen.

Beurteilung der metabolischen Belastung und der Substrattoxizitätseffekte durch Plattieren

Die durch Plattieren geschätzte Zelllebensfähigkeit ist ein physiologischer Schlüsselparameter, der die Fähigkeit der einzelnen Stämme widerspiegeln sollte, den durch die metabolische Belastung und die TCP-Exposition verursachten Belastungen standzuhalten . E. coli Degraders vorinduziert mit 0.2 mM IPTG und Wirtskontrollen wurden vor und nach 5 h Inkubation in Phosphatpuffer mit oder ohne 2 mM TCP plattiert. Der Prozentsatz der überlebenden Zellen wurde nach Inkubation berechnet.

Die aus der Plattierung vor der Inkubation gewonnenen Daten (Abb. 2a) veranschaulichen die getrennten Auswirkungen einzelner Elemente auf die gesamte Stoffwechselbelastung der Zellen. Mehrere Faktoren, einschließlich des Vorhandenseins von Plasmid-DNA und der zugehörigen Selektionsmarker, der Zugabe von IPTG und der Belastung durch die Expression heterologer Pfade, beeinflussten die Lebensfähigkeit der Degrader bereits vor der Zugabe des toxischen Substrats parallel. Der ausgeprägteste Einfluss in diesem Stadium war auf die Plasmiderhaltung und die damit verbundene konstitutive Expression von Selektionsmarkergenen aus den Duet-Vektoren sowie auf das Vorhandensein von IPTG zurückzuführen. Die Anwesenheit von zwei Plasmiden mittlerer bis hoher Kopie pCDF (20-40 Kopien pro Zelle) und pETDuet (~ 40 Kopien pro Zelle) verringerte die Lebensfähigkeit um 50 % (P < 0,01; Abb. 2a). Die „Präinduktion“ der Wirtskontrolle mit leeren Plasmiden reduzierte die Lebensfähigkeit um fast 40 % gegenüber der nicht induzierten Kontrolle (P < 0,01). Die Expression von Pathway-Enzymen in den E. coli-Abbauern verringerte die Lebensfähigkeit weiter um etwa 20% (P < 0,05). Eine zusätzliche Verringerung der Lebensfähigkeit von deg31opt im Vergleich zu degWT und deg31 kann möglicherweise auf den Unterschied in den Antibiotika-Selektionsmarkern zwischen drei Rekombinanten zurückgeführt werden.

Die nach 5 h Inkubation mit oder ohne TCP erhobenen Daten (Abb. 2b und Zusatzdatei 1: Fig. S2) enthielt mehrere unerwartete Beobachtungen. Überraschenderweise hatte TCP (anfänglich in einer Konzentration von 2 mM zugegeben) nur geringe oder vernachlässigbare Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit von nicht induzierten Kontrollzellen, die leere Plasmide tragen; es gab keinen signifikanten Unterschied in der Lebensfähigkeit zwischen diesen Zellen und den Wirtskontrollen, die weder TCP noch IPTG ausgesetzt waren. Dies war unerwartet, da berichtet wurde, dass TCP wachsende Zellen von E. coli BL21 (DE3) und natürlichen Wirten wie A. radiobacter AD1 oder Pseudomonas putida MC4 selbst bei Konzentrationen, die 50% niedriger sind als die hier verwendeten, stark hemmt . Andererseits war der schädliche Effekt von IPTG statistisch signifikant (P < 0,01) (Abb. 2b und Zusatzdatei 1: Fig. S2). Die auffälligste Beobachtung war, dass die relative Lebensfähigkeit von Zellen, die mit IPTG vorinduziert und dann TCP ausgesetzt wurden, fast 90 % niedriger war als die von Wirtskontrollen, die keiner Substanz ausgesetzt waren (P < 0,01) (Abb. 2b). Dieser dramatische Verlust der Lebensfähigkeit entspricht nicht einer einfachen Summe der Einzelwirkungen der beiden Verbindungen; Es ist offensichtlich, dass das IPTG die Toxizität von TCP verschlimmerte. Die Tatsache, dass IPTG die Toxizität von TCP verschlimmerte und nicht umgekehrt, wurde durch die Plattierung von drei Rekombinanten bestätigt, die den synthetischen biologischen Abbauweg tragen (Abb. 2b). Da diese Degrader funktionelle Wege für den TCP-Abbau hatten, waren sie besser in der Lage, ihre Anwesenheit zu tolerieren. Wichtig ist, dass die Lebensfähigkeit der Abbauprodukte umso größer ist, je schneller die Umwandlung von TCP durch die Wegenzyme erfolgt. Deg31opt, das eine schnelle anfängliche Umwandlung von TCP erreichte, aber signifikante Mengen der Zwischenprodukte DCP und GDL akkumulierte, überlebte die 5-h-Inkubation fast genauso gut wie die Wirtskontrolle, die nicht dem Substrat ausgesetzt war. Diese Daten stimmen mit den zuvor berichteten Ergebnissen von Wachstumsstillstandstests überein, die darauf hindeuteten, dass TCP die toxischste Verbindung im Signalweg ist .

Bewertung der metabolischen Belastung und Substrattoxizität durch Multiparameter-Durchflusszytometrie

Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung mehrerer biochemischer und physikalischer Variablen unmittelbar nach der Probenvorbereitung und sollte daher genauere Informationen über den physiologischen Status der Zellen liefern, als dies durch Plattieren möglich ist . Diese Technik bietet auch wichtige Informationen über die Heterogenität von Bakterienpopulationen. Im Gegensatz zur Plattierung wird die Anzahl lebensfähiger Zellen in Originalkulturen nicht unterschätzt, wenn ein Teil der Bevölkerung eine subletale Verletzung erlitten hat und die Wachstumsfähigkeit verloren hat .

Die Inkubation der drei Degrader und Wirtskontrollen wurde unter den im vorherigen Abschnitt genannten Bedingungen durchgeführt. Die nach 5 h Inkubation mit oder ohne TCP entnommenen Proben wurden mit Propidiumiodid (PI), 6-Carboxy-2′,7′-dichlordihydrofluoresceindiacetat (carboxy-H2DCFDA) oder Bis-(1,3-dibutylbarbitursäure) trimethinoxonol gefärbt. Farbstoffe zur Markierung von Nukleinsäuren, wie PI, das nur in Zellen mit kompromittierten Membranen eindringt, werden üblicherweise mit membranpotentialempfindlichen Farbstoffen wie DiBAC4 (3) verwendet, das die lipidhaltigen intrazellulären Komponenten bindet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien zu untersuchen . Carboxy-H2DCFDA ist eine chemisch reduzierte, acetylierte und carboxylierte Form von Fluorescein, die viele Anwendungen als allgemeiner Indikator für das Vorhandensein reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in eukaryotischen und prokaryotischen Zellen gefunden hat . Neuere Studien zur bakteriellen Verwertung von chlorierten aliphatischen Kohlenwasserstoffen legen nahe, dass dieser Prozess mit starkem oxidativem Stress verbunden ist, und wir stellten die Hypothese auf, dass TCP auch eine solche physiologische Reaktion hervorrufen würde . Die Sättigung ungesättigter Fettsäuren durch Halogenierung oder Lipidperoxidation verursacht Veränderungen der Membranfluidität, was zum Zusammenbruch von Elektronentransportketten und vorzeitigem Elektronentransfer zu Sauerstoff führt, begleitet von ROS-Bildung, Membranpermeabilisierung und Zelltod .

Das in unserer Studie angewendete Endpunkt-Durchflusszytometrieprotokoll zeigte weniger sensitiv als erwartet die durch Plasmide verursachte Belastung (Abb. 2b), möglicherweise weil das Vorhandensein von heterologer DNA und die konstitutive Expression von Selektionsmarkern die Eigenschaften, auf die die Zytometrie abzielt, nicht direkt veränderten, sondern stattdessen den Gesamtenergiestatus der Zellen aus dem Gleichgewicht brachten. Der durchflusszytometrische Ansatz unter Verwendung ausgewählter Fluorochrome war jedoch nützlich, um die toxischen Wirkungen von IPTG und TCP aufzudecken. Es gab keine signifikanten Unterschiede (P > 0.05) zwischen den nicht induzierten Wirtskontrollen mit leeren Plasmiden, unabhängig von ihrem TCP-Expositionsstatus, in Bezug auf eine der drei in diesen Experimenten untersuchten Variablen (Membranpermeabilität, ROS-Bildung und Membranpotential; siehe Abb. 2b). Der Anteil der für DiBAC4(3) positiv gefärbten Zellen erhöhte sich jedoch in der mit IPTG allein behandelten Kontrolle bis zum Dreifachen (P < 0,01). Der gleiche Effekt wurde auch bei deg31 beobachtet, dessen Reaktion auf Induktion und Inkubation mit TCP genauer untersucht wurde (Abb. 3). Der Anteil der mit allen drei Farbstoffen positiv gefärbten Bakterienpopulation nahm um ein Vielfaches zu, wenn die Vorbehandlung mit IPTG mit einer TCP-Exposition kombiniert wurde, was die zuvor beobachtete verschlimmernde Wirkung bestätigt und darauf hinweist, dass die Wirkung von TCP in Bakterienzellen mit einer ausgedehnten ROS-Bildung einhergeht (Abb. 2b, 3). Membrandepolarisation, ROS-Akkumulation und Membranpermeabilität wurden in E. coli-Rekombinanten, die den synthetischen biologischen Abbauweg exprimieren, reduziert, wobei der Grad der Reduktion proportional zu den anfänglichen TCP-Umwandlungsraten der Stämme war. Interessanterweise wurde die Exazerbation der Verbindungstoxizität durch Präinduktion der BL21 (DE3) -Wirtskontrolle mit IPTG auch in Experimenten mit der modelltoxischen Verbindung Tert-butylhydroperoxid (TBHP), einem organischen Peroxid und einem stark die ROS-Bildung fördernden Oxidationsmittel, bestätigt (Zusätzliche Datei 1: Abb. S3). Dies legt nahe, dass das beschriebene Exazerbationsphänomen nicht nur auf unser Modell toxischer chemischer TCP beschränkt sein sollte.

Membrandepolarisation und ROS-Bildung in vivo sind dynamische Prozesse. Um ihre Kinetik in E. coli-Degradern zu verfolgen, führten wir auch zeitaufgelöste Messungen durch (Zusätzliche Datei 1: Abb. S4). Die Anzahl der mit DiBAC4(3) und Carboxy-H2DCFDA gefärbten Zellen nahm mit der Zeit in allen gestressten Rekombinanten außer deg31 linear zu. Interessanterweise zeigte dieser Degrader einen anfänglichen Ausbruch von DiBAC4 (3) und Carboxy-H2DCFDA Fluoreszenz, aber diese Signale dann Plateau oder fiel leicht. Wir gehen davon aus, dass die charakteristischen Profile der DiBAC4 (3) – und Carboxy-H2DCFDA-Fluoreszenz für deg31 mit seiner einzigartigen Variante des synthetischen biologischen Abbauweges und dem entsprechenden Zeitverlauf der TCP-Biotransformation zusammenhängen. Im Gegensatz zu den anderen Stämmen waren TCP, 2,3-Dichlorpropan-1-ol (DCP) und Glycidol (GDL) in relativ hohen Konzentrationen in der deg31-Reaktionsmischung zwischen Minute 50 und 100 der Messperiode vorhanden. Dies kann synergistische Toxizität verursacht haben, wodurch die Anzahl der Zellen mit depolarisierten Membranen erhöht und die ROS-Bildung verbessert wurde. Solche gemeinsamen Effekte sind häufig; Sie wurden unter anderem für Organophosphat-Pestizide, Fluortenside und Schwermetalle beobachtet . Das anschließende Einfrieren oder moderate Absinken der Intensität der Signale wurde auf die parallele Entfernung von TCP und GDL und die Produktion von Glycerin zurückgeführt, von dem bekannt ist, dass es ein effizientes Stressschutzmittel in Hefen und lösungsmitteltoleranten Stämmen von E. coli ist .

Die in deg31 vorhandene Variante des Syntheseweges schien den besten Kompromiss in Bezug auf die Bewältigung der Toxizität bei effizienter Umwandlung von TCP in harmloses Glycerin zu bieten und wurde daher für weitere Untersuchungen ausgewählt.

Elektronenmikroskopische Beurteilung der metabolischen Belastung und Substrattoxizität

Metabolische Belastung und Toxizität können Veränderungen in der Morphologie bakterieller Wirte verursachen . Wir verwendeten daher Transmissionselektronenmikroskopie, um die Veränderungen in der Morphologie von induzierten und nicht induzierten deg31-Zellen nach 5 h Inkubation mit oder ohne 2 mM TCP zu untersuchen (Abb. 3). Bilder von induzierten und nicht induzierten E. coli-Wirtskontrollzellen mit leeren Plasmiden sind in (Zusatzdatei 1: Abb. S5). Auf mikroskopische Beobachtungen folgte eine Multiparameter-Durchflusszytometrie von deg31-Zellen, die mit PI, Carboxy-H2DCFDA oder DiBAC4 (3) gefärbt waren.

Die Inkubation von nicht induzierten Degradern mit TCP erzeugte nur einen geringen Anteil toter Bakterienzellen, und die Morphologie der so behandelten Zellen unterschied sich im Allgemeinen nicht von der der Zellen, die dem toxischen Substrat nicht ausgesetzt waren (Abb. 3a, b). Der Anteil der mit Carboxy-H2DCFDA und PI gefärbten Zellen nahm moderat zu, es wurde jedoch kein Effekt auf das Membranpotential beobachtet. Präinduzierte Bakterien, die rekombinante Proteine produzieren, bildeten intensiv sichtbare Einschlusskörper und zeigten eine häufige Trennung der zytoplasmatischen Membran von der äußeren Membran an den Polen der Zelle (Abb. 3c). Da die Mehrheit der aus Zelllysaten erhaltenen rekombinanten Proteine löslich war (Daten nicht gezeigt), glauben wir, dass die beobachteten Körper aus aktiven Enzymen bestanden.

Die Kombination von Präinduktion und Inkubation mit TCP führte zu den ausgeprägtesten morphologischen Veränderungen und ging mit einem deutlichen Anstieg der Anzahl der Zellen einher, die positiv auf PI, Carboxy-H2DCFDA und DIBAC4(3) anfärbten (Abb. dreidimensional). Zahlreiche tote oder sterbende Zellen mit beschädigten Zytoplasmamembranen und ausgetretenem Inhalt waren deutlich sichtbar. Trotzdem widersetzte sich ein erheblicher Teil der Bevölkerung den kombinierten Wirkungen von IPTG und TCP über den 5-stündigen Behandlungszeitraum. Dies war hauptsächlich auf den ausgewogenen Syntheseweg von deg31 und seine schnelle Umwandlung von TCP in Glycerin zurückzuführen. Die Bistabilität ist ein weit verbreitetes Phänomen und kann auf Veränderungen in der Expression der multigenen Merkmale zurückgeführt werden, die für die Toxizitätstoleranz und die abgestufte Stressreaktion in der Bakterienpopulation verantwortlich sind . Zusammenfassend waren unsere mikroskopischen Beobachtungen von deg31-Populationen, die unter vier verschiedenen Bedingungen behandelt wurden, mit früheren Ergebnissen konsistent und stützten die Schlussfolgerung, dass die Präinduktion mit IPTG die TCP-Toxizität verschlimmert.

Toxizitäts-Exazerbationseffekt steigt in Zellen mit metabolischer Belastung durch Plasmide

Da sowohl die E. coli-Degrader als auch die in dieser Arbeit verwendeten Wirtskontrollen die metabolische Belastung der Duet-Plasmide und des LacIQ / P lacUV5 -T7-Expressionssystems bewältigen mussten, entschieden wir uns, E. coli-Kontrollen ohne diese Komponenten in das folgende Experiment aufzunehmen. Dazu verwendeten wir E. coli BL21(DE3) ohne Plasmide und den Klonierungsstamm E. coli DH5a, dem sowohl das LacIQ/P lacUV5 -T7 Expressionssystem als auch das lac Operon fehlen. Unter Verwendung der oben beschriebenen Plattierungs- und Durchflusszytometrieprotokolle stellten wir fest, dass der Exazerbationseffekt in beiden Stämmen moderat oder vollständig abwesend war (Zusätzliche Datei 1: Abb. S6A, B). Dies deutet darauf hin, dass sich der Doppelstress von IPTG und TCP nur in Stämmen manifestiert, die Duet-Plasmide und das entsprechende Expressionssystem tragen.

Wir vermuten, dass die untersuchten Rekombinanten den Doppelstress von IPTG und dem toxischen Substrat aufgrund der metabolischen Belastung durch Plasmide und der entsprechenden Ressourcenknappheit für die Zellerhaltung nicht effizient unterdrücken konnten. Es scheint, dass die chemische Struktur von IPTG, sein Transport oder seine Anwesenheit in der Zelle physiologische Veränderungen auslöst, die die Manifestation der TCP-Toxizität in E. coli BL21 (DE3) -Zellen mit Duet-Plasmiden erleichtern.

Verringerung der metabolischen belastung und toxizität exazerbation durch tuning IPTG konzentration

Nächste, wir versucht zu reduzieren die belastung auferlegt auf E. coli rekombinanten durch optimierung der konzentration von IPTG. Wir suchten nach der niedrigstmöglichen Konzentration des Induktors, die die Fitnesskosten minimieren würde, ohne die Effizienz des Systems bei sich verschlechternden TCP signifikant zu beeinträchtigen. Deg31-Zellen wurden mit IPTG-Konzentrationen im Bereich von 0,01 bis 1,00 mM vorinduziert und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit und die Effizienz des Signalwegs untersucht (Abb. 4; Zusatzdatei 1: Abb. S7).

E. coli BL21 (DE3) mit den leeren pETDuet- und pCDF-Plasmiden wurde als Kontrolle für die Plattierung verwendet, um die Belastung des Wirts durch IPTG-Exposition in Abwesenheit des heterologen Weges zu beurteilen (Abb. 4). Die Lebensfähigkeit des präinduzierten Degraders und der Kontrolle wurde vor und nach 5 h Inkubation in Phosphatpuffer mit 2 mM TCP überprüft und mit der von nicht IPTG exponierten Zellen verglichen (Fig. 4a, b). Der Prozentsatz der überlebenden Zellen nach Inkubation wurde jeweils berechnet (Fig. 4c). Diese Experimente zeigten, dass auch in Abwesenheit von TCP eine inverse Korrelation zwischen der IPTG-Konzentration und der Lebensfähigkeit der rekombinanten E. coli bestand (Abb. 4a). Der deg31-Stamm litt mehr unter steigenden IPTG-Konzentrationen als die Kontrolle, wahrscheinlich aufgrund der zusätzlichen Belastung durch die Expression von Genen, die für den Syntheseweg kodieren. Das Gegenteil war nach 5 h Inkubation der Fall, da der TCP-katabolisierende deg31-Stamm resistenter gegen eine verschärfte Toxizität war als die Wirtskontrolle (Abb. 4b, c). Der Stamm des synthetischen Signalwegs zeigte ähnliche Überlebensraten bei allen getesteten IPTG-Konzentrationen mit Ausnahme der höchsten – die relative Lebensfähigkeit von deg31, das mit 1 mM IPTG präinduziert wurde, betrug 100 %. Wir gingen davon aus, dass dieser Randwert auf eine Unterschätzung der Anzahl lebensfähiger Zellen vor der Inkubation zurückzuführen war, da der Degrader bei Induktion mit einer so hohen Konzentration an IPTG und dem daraus resultierenden Vorhandensein lebensfähiger, aber nicht kultivierbarer Zellen in der Suspension intensiven Stress ausgesetzt war . Die Experimente zeigten, dass ein Teil der Bakterienpopulation einige Zeit nach der Behandlung mit dieser hohen IPTG-Konzentration seine Wachstums- und Fortpflanzungsfähigkeit wiedererlangte (Zusatzdatei 1: Abb. S8).

Die Zeitverläufe der TCP-Biotransformation mit ruhenden Zellen von deg31 wurden mit IPTG bei 1,00, 0,20, 0,05, 0,025 und 0,01 mM vorinduziert (Zusätzliche Datei 1: Abb. S7) und densitometrische Analyse von SDS-Polyacrylamidgelen mit den entsprechenden Proben zellfreier Extrakte (Zusatzdatei 1: Abb. S9, Tabelle S1) zeigte, dass: (i) das relative Verhältnis der Signalwegenzyme und die Form des Abbauprofils änderten sich mit der Induktorkonzentration nicht wesentlich, während (ii) der Gehalt der drei Signalwegenzyme im gesamten löslichen Protein der rekombinanten Bakterien von 55 % (1 mM IPTG) auf 32% (0,01 mM IPTG) abnahm und die Leistung des Signalwegs von 70 auf 46% abnahm. Aufgrund der Undichtigkeit des T7-Promotors und der basalen Expression von Genen innerhalb des Signalwegs wurde auch bei nicht induzierten Zellen eine nennenswerte Umwandlung von TCP erreicht (Zusätzliche Datei 1: Abb. S7).

Abbildung 5 fasst das Gleichgewicht der drei Parameter zusammen, die in den vorhergehenden Abschnitten erörtert wurden: (i) Wirtslebensfähigkeit, (ii) zelluläre Expression von Signalwegenzymen und (iii) Ausgabe des synthetischen biologischen Abbauweges. Wir schließen daraus, dass die minimale IPTG-Konzentration, die eine ausreichende Expression von Genen innerhalb des Signalwegs ermöglicht, um eine angemessene Leistung zu erzielen, 0,025 mm beträgt. Ähnliche Induktorkonzentrationen, die eine vollständige Genexpression ermöglichen, wurden für einzelne rekombinante Proteine wie β-Galactosidase, grün fluoreszierendes Protein und Rhamnulose-1-Phosphat-Aldolase berichtet . Beachten Sie, dass die IPTG-Konzentration von 0,025 mM achtmal niedriger ist als die ursprünglich getestete Induktorkonzentration und bis zu 40-mal niedriger als die in der wissenschaftlichen Literatur angegebenen Werte, die die Entwicklung heterologer Signalwege in E. coli beschreiben . Die Induktion mit geringeren Mengen an IPTG verbesserte die Fitness des Wirts. Selbst die niedrigste Konzentration von 0,01 mM reduzierte jedoch die Lebensfähigkeit des E. coli-Degraders um 30 % gegenüber nicht induziertem deg31 und um bis zu 50% gegenüber der nicht induzierten Wirtskontrolle (P < 0,05 in beiden Fällen; Fig. 4b). Wir untersuchten daher die Möglichkeiten, IPTG durch einen alternativen Induktor zu ersetzen.

Verringerung der Stoffwechselbelastung und Toxizitätsverschärfung durch Induktion mit Lactose

Lactose ist ein natürlicher Induktor des Lac-Operons und kann als billigere Alternative zu synthetischem IPTG eingesetzt werden. Es wurde nachgewiesen, dass es die Expression rekombinanter Proteine in E. coli im gleichen Maße wie IPTG sowohl im Labor- als auch im industriellen Maßstab induziert . Im Gegensatz zu IPTG ist Lactose ein Substrat der β-Galactosidase (kodiert durch lacZ) und kann daher von Zellen mit einem intakten Lac-Operon, einschließlich E. coli BL21 (DE3), metabolisiert werden. Daher werden üblicherweise Konzentrationen von Lactose bis zu 30 mM verwendet, um die Expression klonierter Gene in Konzentrationen zu induzieren, die mit ≤1 mM IPTG erreicht werden können .

Wir untersuchten die Präinduktion von deg31-Zellen mit 1 mM Lactose. Wir nahmen an, dass diese Konzentration ausreichen würde, um die Expression der TCP-Abbauweggene auf einem Niveau zu induzieren, das eine ausreichende Abbaueffizienz verleihen würde. Diese Erwartung wurde durch aufgezeichnete Zeitverläufe der TCP-Biotransformation und den Befund bestätigt, dass Pathway-Enzyme unter diesen Bedingungen bis zu 41 % des gesamten löslichen Proteins der Zellen ausmachten (Zusätzliche Datei 1: Abb. S7 und S9 sowie Tabelle S1). Der theoretische Umsatz von TCP zu Glycerin betrug unter diesen Bedingungen 63 %. Diese Werte liegen nahe bei denen, die für deg31-Zellen beobachtet wurden, die mit 0, 025 oder 0, 05 mM IPTG vorinduziert wurden. Am wichtigsten ist, dass die mit Lactose vorinduzierten deg31-Zellen vor und nach 5-stündiger Inkubation mit TCP eine höhere Lebensfähigkeit aufwiesen als mit IPTG behandelte Bakterien in jeder der getesteten Konzentrationen (P < 0,05; Abb. 4). Der gleiche entlastende Effekt wurde für die Wirtskontrolle beobachtet. In Bezug auf das Überleben schnitten die mit Lactose vorinduzierten Zellen fast genauso gut ab wie ihre nicht induzierten Gegenstücke (Abb. 4c). In Übereinstimmung mit den Testergebnissen ergab die durchflusszytometrische Analyse von Wirtskontroll- und deg31-Zellen, die mit Lactose vorinduziert wurden, signifikant niedrigere Konzentrationen von gestressten Zellen mit depolarisierten Membranen als bei mit IPTG vorinduzierten E. coli-Stämmen (P < 0,01; Zusätzliche Datei 1: Abb. S10). Diese Ergebnisse zeigten erneut, dass die Wirkung von IPTG in den untersuchten Rekombinanten durchweg von Veränderungen der Membraneigenschaften begleitet war.

Eine höhere Lebensfähigkeit von Zellen, die mit Lactose anstelle von IPTG induziert wurden, wurde zuvor für die Expression einzelner heterologer Proteine berichtet . Dieser Effekt wurde auf die verzögerte, mildere Induktion zurückgeführt, die mit dem natürlichen Induktor erreicht wurde. Im Gegensatz zu synthetischem IPTG, das sowohl durch passive Diffusion als auch mit Hilfe der LacY-Lactose-Permease schnell in die Zelle gelangen kann, kann Lactose nur über die Permease in das Zytoplasma gelangen. Darüber hinaus muss Lactose durch β-Galactosidase in Allolactose umgewandelt werden, bevor sie an den Lac-Repressor bindet, während IPTG direkt an den Repressor bindet. Unsere Ergebnisse bestätigen, dass Laktose eine geringere metabolische Belastung als IPTG verursacht, was darauf hindeutet, dass es auch ein geeigneterer Induktor für die Expression ganzer heterologer Signalwege in E. coli BL21 (DE3) ist. Dies ist besonders wichtig für E. coli BL21 (DE3) -Zellen, die synthetische Wege tragen, die toxische Verbindungen abbauen oder toxische Zwischenprodukte produzieren.