Ergebnisse und Diskussion
Die PCR-RFLP-Analyse ergab Restriktionsmuster, die mit der In Silico-Analyse kompatibel sind. Alle Hunde mit Schwanzfehlbildung zeigten das gleiche Muster (3 Fragmente, 2 sichtbare Bänder), das sich von dem von Hunden mit normalem Schwanz (2 Fragmente, 1 sichtbares Band) unterschied (Abb.1). Ein weiterer Assay, ebenfalls basierend auf PCR-RFLP, wurde erfolgreich verwendet, um die gleiche Mutation im T-Gen von Hunden zu identifizieren, jedoch unter Verwendung eines Polyacrylamid-Gelelektrophoresesystems (Gruszczynska & Czapla 2011). Die Leistung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese könnte die Auflösung von Banden relativ zu DNA-Fragmenten in der vorliegenden Studie verbessern. Die Praktikabilität würde jedoch reduziert, da dieses System mühsamer ist. Obwohl es in der vorliegenden Studie nicht möglich war, alle nach dem Aufschluss erzeugten DNA-Fragmente zu visualisieren, konnten Genotypen mithilfe der Agarosegelelektrophorese leicht unterschieden werden.
Abb.1. PCR-RFLP zum Nachweis der C189G-Mutation. Marker der Basenpaare (M), betroffene Hunde – kurzer Schwanz (1-7) und Tier mit normalem Schwanz (8).
Bei der Analyse von sequenzierten Proben wurde Heterozygotie C (Cytosin) G (Guanin) im Nukleotid 189 von Exon 1 nur bei Hunden mit Schwanzfehlbildung beobachtet. Der Ort der Mutation basierte auf der in der Genbank verfügbaren T-Gen-mRNA-Sequenz (Accession number: AJ245513).
Bei der In-Silico-Analyse wurde auch eine Veränderung der Aminosäure 63 von Isoleucin zu Methionin beobachtet. Alle in der vorliegenden Studie erhaltenen DNA-Sequenzen wurden in der Genbank unter den Zugangsnummern hinterlegt: MF495488 (kurzer Schwanz), MF495489 (Fehlen des Schwanzes), MF495490 (Fehlen des Schwanzes) und MF495491 (normaler Schwanz).
Obwohl nur ein Genotyp für die vorliegende Erkrankung gefunden wurde (CG für Tiere mit Schwanzfehlbildung), wurde bei betroffenen Hunden eine phänotypische Variation beobachtet, nämlich die Schwanzgröße. Einige Tiere zeigten einen kurzen Schwanz (ungefähr 3-4 Wirbel), und andere zeigten das Fehlen eines Schwanzes (ungefähr 1-2 Wirbel) (Abb.2). Ähnliche Phänotypen wurden auch von Haworth et al. (2001) bei Hunden. Obwohl eine Erklärung dafür bei Hunden noch nicht bekannt ist, Buckingham et al. (2013), die die angeborene Schwanzgrößenvariation bei Katzen untersuchten, fanden Hinweise auf eine Haploinsuffizienz, die durch multiple Mutationen im T-Gen verursacht wurde. C.1199delC-, c.1169delC- und c.998delT-Mutationen waren mit unterschiedlichen Ebenen der Genexpression assoziiert, was die unterschiedlichen Phänotypen bei Hunden mit Schwanzfehlbildung erklären könnte (Buckingham et al. 2013).
Abb.2. (A) Hund, der die Mutation C189G im T-Gen trägt. (B) Hund aus demselben Wurf ohne C189G-Mutation.
Der erbliche Charakter der Mutation kann durch die Herediogrammanalyse nachgewiesen werden (Abb.3) des untersuchten Wurfes. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Mutation ein autosomal dominantes Vererbungsmuster aufweist. In der vorliegenden Studie wurde jedoch kein dominanter homozygoter (GG) Genotyp gefunden, was die Beobachtungen verstärkt, dass das mutierte T-Gen bei Homozygose den Tod des Fötus verursacht (Haworth et al. 2001). Hytonen et al. (2009) beobachteten, dass Würfe aus Kreuzungen zwischen Normalschwanztieren (CC-Genotyp) 29% größer waren als Würfe aus Kreuzungen zwischen missgebildeten Schwanztieren (CG-Genotyp). Dieses Ergebnis ist mit der erwarteten Reduktion von 25% bei Nachkommen aus Kreuzungen mit tödlichen Allelen vereinbar.
Abb.3. Herediogramm, das das Vererbungsmuster der C189G-Mutation im T-Gen des Labrador Retriever zeigt. Kreuzung zwischen Großeltern mütterlicherseits (I), Wurf des betroffenen Hundes und seine Kreuzung mit normalem Rüden (II) und Wurf analysiert (III).
Mutationen im T-Gen wurden mit Schwanzfehlbildungen bei anderen Spezies wie Mäusen und Katzen in Verbindung gebracht (Wilson et al. 1995: Buckingham et al. 2013). Und in einigen von ihnen werden auch andere Veränderungen beobachtet, wie Harn- und Stuhlinkontinenz bei Katzen (Robinson 1993). Bei Hunden wurde jedoch bisher nur eine Schwanzfehlbildung bei heterozygoten Tieren (CG) beobachtet (Indrebo et al. 2008). Obwohl bei einigen Hunderassen der Phänotyp „Schwanzfehlbildung“ nicht mit der C189G-Mutation assoziiert war (Boston Terrier, Englische Bulldogge, King Charles Spaniel, Zwergschnauzer, Parson Russell Terrier und Rottweiler), deutet die große Anzahl der betroffenen Rassen auf eine alte Mutation hin (Hytonen et al. 2009), in Ahnenhunden vor der Bildung vieler Rassen vorhanden. Interrassische Kreuzungen können jedoch auch zur Mutationsdiffusion beigetragen haben, da die meisten heterozygoten Tiere keine Veränderungen der Libido oder der Fortpflanzungsleistung zu haben scheinen. Ein weiterer Faktor, der zur Mutationsdiffusion beigetragen haben könnte, war die Verwendung bei der Reproduktion von Hunden ohne Schwanz, als die ästhetische Kaudektomie noch erlaubt war. In dieser Zeit ist es wahrscheinlich, dass viele Tiere mit Schwanzagenese als Reproduktoren verwendet wurden, da bei einigen Rassen Schwanzabwesenheit wünschenswert war, was zur Mutationsdiffusion beitrug.
Derzeit ist die Praxis der Kaudektomie (chirurgische Schwanzentfernung) in mehreren Ländern der Welt, wie in der Europäischen Union und in Brasilien, ein verbotenes Verfahren (Haworth et al. 2001, CFMV 2013). In einigen Ländern der Europäischen Union werden Gentests zur Identifizierung der C189G-Mutation im T-Gen verwendet, um zu überprüfen, ob das Fehlen eines Schwanzes bei einigen Rassen angeborenen Ursprungs ist oder ob die Tiere einem chirurgischen Eingriff unterzogen wurden. Die in der vorliegenden Studie verwendete PCR-RFLP war eine einfache und genaue Technik zur Identifizierung dieser Mutation und könnte als Beweis für die Identifizierung illegaler Kaudektomiepraktiken verwendet werden.
Aufgrund des Mangels an Informationen über die C189G-Mutation im T-Gen von Hunden gibt es keine weiteren Informationen über ihre Assoziation mit anderen morphologischen oder sogar physiologischen Merkmalen und muss daher untersucht werden.