Gelfiltrationschromatographie

Anwendungen der Gelfiltrationschromatographie

Die Gelfiltrationschromatographie, eine Art Größenausschlusschromatographie, kann verwendet werden, um Moleküle und Komplexe in einer Probe entweder in Fraktionen mit einem bestimmten Größenbereich zu fraktionieren, alle Moleküle, die größer als eine bestimmte Größe sind, aus der Probe zu entfernen, oder eine Kombination beider Vorgänge. Die Gelfiltrationschromatographie kann verwendet werden, um Verbindungen wie kleine Moleküle, Proteine, Proteinkomplexe, Polysaccharide und Nukleinsäuren in wässriger Lösung zu trennen. Bei Verwendung eines organischen Lösungsmittels als Laufmittel wird das Verfahren stattdessen als Gelpermeationschromatographie bezeichnet.

Die Gelfiltrationschromatographie kann auch zur:

• Fraktionierung von Molekülen und Komplexen innerhalb eines vorgegebenen Größenbereichs
• Größenanalyse und -bestimmung
• Entfernung großer Proteine und Komplexe
• Pufferaustausch
• Entsalzung
• Entfernung kleiner Moleküle wie Nukleotide, Primer, Farbstoffe und Verunreinigungen
• Beurteilung der Probenreinheit
• Trennung von gebundenen von ungebundenen Radioisotopen

Gelfiltrationschromatographiemedien für alle oben genannten Anwendungen sind in vorgepackten Schwerkraftströmungssäulen, Spinsäulen, Niederdruck- und Mitteldruckchromatographiesäulen und Flaschenharze.

Gelfiltrationschromatographiemechanismus

In einer Gelfiltrationschromatographiesäule besteht die stationäre Phase aus einer porösen Matrix, und die mobile Phase ist der Puffer, der zwischen den Matrixperlen fließt. Die Beads haben einen definierten Porengrößenbereich, den sogenannten Fraktionierungsbereich. Moleküle und Komplexe, die zu groß sind, um in die Poren einzudringen, bleiben in der mobilen Phase und bewegen sich mit dem Pufferfluss durch die Säule. Kleinere Moleküle und Komplexe, die sich in die Poren bewegen können, treten in die stationäre Phase ein und bewegen sich durch die Gelfiltrationssäule auf einem längeren Weg durch die Poren der Perlen.

Jedes Molekül oder Komplex, das über dem Fraktionierungsbereich für eine bestimmte Gelfiltrationschromatographiesäule liegt, bewegt sich schneller durch die Säule als jedes Molekül, das in die stationäre Phase eintreten kann. Daher eluiert jeder Bestandteil in der Probe, der sich oberhalb des Fraktionierungsbereichs befindet, zuerst (im Hohlraumvolumen) vor allem, was sich im Fraktionierungsbereich befindet. Die Mindestgröße, die in der mobilen Phase verbleibt und nicht in die stationäre Phase eintritt, wird als Ausschlussgrenze bezeichnet. Bio-Rad bietet Gelfiltrationschromatographiemedien und -säulen mit Ausschlussgrenzen in drei Größenordnungen von 100 Dalton bis 100.000 Dalton (100 kDa) an.

Moleküle und Komplexe, die in die stationäre Phase eintreten können, werden nach ihrer Größe fraktioniert. Kleinere Moleküle wandern tief in die Poren und werden stärker verzögert als größere Moleküle, die nicht so leicht in die Poren gelangen und somit schneller aus der Säule eluiert werden. Dieser Unterschied in der Porenmigration führt zu einer Fraktionierung der Komponenten nach Größe, wobei die größte Eluierung zuerst erfolgt.

In Gelfiltrationschromatographiesäulen, die zum Entsalzen, Pufferaustausch und zur Entfernung kleiner Moleküle wie Nukleotide ausgelegt sind, dringen die Salze und kleinen Verbindungen leicht in die Poren ein, werden verzögert und wandern langsamer durch die Säule als die größeren Proteine oder Nukleinsäuren. Daher werden die interessierenden Komponenten in der Probe vor Salzen, Nukleotiden usw. eluiert. DNA-Bereinigungskits, die diesen Mechanismus verwenden, enthalten häufig Spinsäulen zur Gelfiltration.

Die Auflösung, hier definiert als die Schärfe der Grenzen zwischen Größenbrüchen, wird durch die Perlengröße und eine Reihe anderer Faktoren bestimmt. Eine kleinere Perlgröße ergibt im Allgemeinen eine höhere Auflösung in einer Gelfiltrationschromatographiesäule. Kompakte Moleküle diffundieren schneller durch die stationäre Phase als lineare Moleküle. Größenausschluss, Fraktionierungsbereich und Elutionsrate werden durch Pufferzusammensetzung, Ionenstärke und pH-Wert beeinflusst. Für die Fraktionierung komplexer Proteingemische müssen möglicherweise Elutionszeiten und Größenausschlussgrenzen empirisch bestimmt werden.

Gelfiltrationschromatographiemedien

Ein wichtiges Kriterium für Gelfiltrationschromatographiemedien ist, dass die Medien inert sind und dass nichts in der Probe oder ein Puffer an die Medien bindet. Eine weitere Überlegung ist die Art der verwendeten Gelfiltrationssäule und ob sie in einem Druckchromatographiesystem oder in Schwerkraftstrom- oder Spinsäulen verwendet wird. Wenn ein Druckchromatographiesystem verwendet wird, müssen sowohl die Säule als auch die Medien den verwendeten Druck und die Durchflussraten tolerieren können.

Üblicherweise verwendete Medien für die Gelfiltrationschromatographie basieren auf Agarose- oder Polyacrylamidperlen, Dextrose für Schwerkraft- oder Niederdrucksysteme und polymeren Harzen für Mitteldrucksysteme. Die Wahl der Medien hängt von den Eigenschaften der zu trennenden Komponenten und anderen experimentellen Faktoren ab. Das Folgende sind allgemeine Überlegungen bei der Bestimmung der Wahl der Gelfiltrationschromatographiemedien:

• Fraktionierung bereich
• Größe ausschluss grenze
• Betriebsdruck
• Fluss rate
• Probe viskosität
• pH bereich
• Autoklavierbarkeit
• Toleranz für wasser mischbar organische Lösungsmittel; Einige Proben können in einer Wasser-organischen Mischung löslicher sein
• Toleranz gegenüber Detergenzien, chaotropen Mitteln, Formamid usw.
• Betriebstemperatur

Die Probentypen, die Auswahl der Medien und die Einrichtung des Chromatographiesystems bestimmen, welche Parameter für eine bestimmte Reinigungsanwendung am wichtigsten sind.