Ein ähnlicher genetischer Code wird von den meisten Organismen auf der Erde verwendet, aber verschiedene Organismen haben unterschiedliche Präferenzen für die Codons, mit denen sie bestimmte Aminosäuren kodieren. Dies ist möglich, weil es 4 Basen (A, T, C und G) und 3 Positionen in jedem Codon gibt. Es gibt daher 64 mögliche Codons, aber nur 20 Aminosäuren und 3 Stop-Codons, die codiert werden müssen, so dass 41 Codons nicht berücksichtigt werden. Das Ergebnis ist Redundanz; Mehrere Codons kodieren einzelne Aminosäuren. Evolutionäre Einschränkungen haben geformt, welche Codons bevorzugt in welchen Organismen verwendet werden – Organismen haben eine Voreingenommenheit bei der Verwendung von Codons.
Sie finden viele Codontabellen, die zeigen, welche Codons welche Aminosäuren kodieren (siehe Beispiel rechts). Mit solch einfachen Regeln könnten Sie denken, dass es einfach ist, eine praktikable DNA-Sequenz zu entwickeln, um Ihr interessierendes Peptid zu codieren und dieses Peptid in Ihrem Organismus der Wahl zu produzieren. Leider machen Codonpräferenzen es so, dass Sie nicht zufällig zwischen den möglichen Codons wählen können und erwarten, dass Ihre Sequenz in jedem Organismus gut exprimiert wird.
Was sind also die evolutionären Zwänge, die zu diesen Präferenzen führen, und was können wir dagegen tun? Lesen Sie weiter, um es herauszufinden!
Warum haben Organismen unterschiedliche Codon-Nutzungsverzerrungen?
Die Gründe für unterschiedliche Codonpräferenzen unter Organismen sind nicht vollständig verstanden, aber einige mögliche Gründe sind:
- Metabolischer Druck – Es braucht zelluläre Ressourcen, um tRNAs zu produzieren, die verschiedene Codons erkennen, die tRNAs korrekt modifizieren und die tRNAs mit den entsprechenden Aminosäuren aufladen. Wenn ein Organismus nur eine Teilmenge von Codons verwendet, muss er nur eine Teilmenge geladener tRNAs produzieren und benötigt daher möglicherweise weniger Ressourcen für den gesamten Translationsprozess. Beispielsweise reguliert E. coli unter Bedingungen mit hoher Wachstumsrate bevorzugt die Produktion von tRNAs, die Codons erkennen, die in hochexprimierten Genen gefunden wurden (Emilsson und Kurland, 1990).
- Kontrolle der Genexpression durch Gensequenz – Proteine, die von Codons mit geringer Häufigkeit oder schlecht geladenen tRNAs kodiert werden, können mit einer geringeren Rate produziert werden als Proteine, die von hochreichenden, geladenen tRNAs kodiert werden. Zum Beispiel Tuller et al. es wurde festgestellt, dass die Translationseffizienz sowohl in E. coli als auch in S. cerevisiae gut mit dem Codon-Bias korreliert.
- Proteinfaltung – Wenn ein Protein durch eine Mischung von Codons mit hoch und schlecht geladenen tRNAs kodiert wird, können verschiedene Regionen des Proteins mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten translatiert werden. Das Ribosom wird sich schnell entlang von Regionen bewegen, die reichlich geladene tRNAs fordern, aber bei Regionen, die wenig geladene tRNAs fordern, stehen bleiben. Wenn das Ribosom zum Stillstand kommt, kann dies den schnell übersetzten Regionen die Möglichkeit geben, sich richtig zu falten. Zum Beispiel fanden Pechmann und Frydman heraus, dass nicht optimale Codons in 10 eng verwandten Hefestämmen mit spezifischen Sekundärstrukturen assoziiert sind.
- Anpassung an veränderte Bedingungen – Organismen müssen oft Gene auf verschiedenen Ebenen unter verschiedenen Bedingungen exprimieren. Bei variierter Codonverwendung kann ein Organismus ändern, welche Proteine stark exprimiert werden und welche schlecht exprimiert werden, indem spezifische tRNA-Pools produziert und geladen werden. Beispielsweise können tRNAs, die in Genen verwendet werden, die für Aminosäure-biosynthetische Enzyme kodieren, während des Aminosäuremangels bevorzugt geladen werden, was zu einer höheren Produktion von Aminosäure-biosynthetischen Enzymen führt (Dittmar et al., 2005).
Wie wirkt sich Codon Usage Bias auf meine Experimente aus?
Während Codonpräferenzen für Organismen sehr nützlich sein können, können sie für Forscher, die versuchen, Proteine in heterologen Wirten zu exprimieren, problematisch sein. Wenn Sie beispielsweise ein interessierendes Gen einfach aus dem menschlichen Genom amplifizieren, exprimiert es möglicherweise überhaupt nicht in E. coli (Sie können eine Vielzahl von Datenbanken finden, die die Codonpräferenzen verschiedener Organismen online zeigen). Selbst wenn das Gen übersetzt wird, kann es nicht richtig funktionieren. Dies ist das Ergebnis einer Nichtübereinstimmung zwischen menschlicher und E. coli-Codonpräferenz. Einige beim Menschen häufig verwendete Codons sind bei E. coli überhaupt nicht üblich und umgekehrt. Bei der Translation dieser Codons kann das Ribosom daher an ungeeigneten Stellen stehen bleiben oder es nicht durch das gesamte Transkript schaffen, was zur Produktion von nicht funktionellen Proteinen bzw. Proteinfragmenten führt.
Lösung des Problems der Verzerrung der Codonnutzung – Codonoptimierung und Expression alternativer tRNAs
Codonoptimierung
Bei der kostengünstigen DNA-Synthese besteht eine der Hauptmethoden, mit denen Forscher das Problem der Codonwahl lösen, darin, Gene so zu resynthetisieren, dass ihre Codons für den gewünschten Expressionswirt besser geeignet sind. Dies wird als „Codon-Optimierung“ bezeichnet.“ Obwohl theoretisch einfach, ist dies nicht so einfach, wie es sich anhört. Selbst für relativ kurze Peptide kann es viele Möglichkeiten geben, sie zu codieren, und was das „geeignete“ Codon ausmacht, ist nicht unbedingt offensichtlich.
Du denkst vielleicht: „Unsinn! Ich sollte einfach das Codon mit dem am häufigsten vorkommenden Pool geladener tRNAs in meinem Wirtsorganismus für jede Aminosäure auswählen, die ich codieren möchte „, aber wie oben beschrieben, sollte nicht jede Region eines Proteins notwendigerweise schnell übersetzt werden, um ein Protein zu produzieren, das richtig funktioniert.
Sie könnten dann denken: „Okay, ich werde nur sicherstellen, dass die Häufigkeit der Codons, die ich für den Wirt auswähle, mit der Häufigkeit der Codons übereinstimmt, die im nativen Organismus verwendet werden.“ Dies ist möglicherweise eine bessere Idee und wurde in der Vergangenheit erfolgreich eingesetzt (Angov et al., 2008), aber es gibt noch viele weitere Funktionen, die beim Entwerfen eines vollständigen Gens berücksichtigt werden müssen. Eine nicht erschöpfende Liste enthält:
- Codonhäufigkeit relativ zur verwandten tRNA-Häufigkeit
- Repetitive Sequenzen
- Restriktionsstellen
- Sequenzen, die dazu neigen, Sekundärstrukturen in RNA-Transkripten zu erzeugen
- Auswirkungen auf die Transkription (Denken Sie daran, es geht nicht nur um Translation – z. B. kann die Codonwahl die Bindungsstellen des Transkriptionsfaktors unterbrechen)
Wie Sie sich vorstellen können, ist es für den Menschen nicht einfach, all diese Faktoren selbst auszugleichen. Glücklicherweise haben viele Forscher Codon-Optimierungsalgorithmen entwickelt und DNA-Synthese-Unternehmen wie IDT und GenScript hosten Online-Codon-Optimierungstools. Denken Sie daran, dass nur weil Sie ein Gen mit einem dieser Tools optimieren, dies nicht unbedingt bedeutet, dass das Gen gut exprimiert wird. Wenn Sie eine gute Expression erzielen, sollten Sie das produzierte Protein auch funktionell analysieren, um sicherzustellen, dass es sich richtig gefaltet hat.
Möglicherweise können Sie vermeiden, dass Ihre Gene von Interesse Codon optimiert werden, indem Sie Plasmide bestellen, die sie von Addgene enthalten. Wenn ein Plasmid bei Addgene ein Gen enthält, das für einen bestimmten Organismus codonoptimiert wurde, wird dies manchmal (aber nicht immer) im Feld „Mutation“ auf der Plasmidseite vermerkt (siehe beispielsweise Plasmid 87904). Da viele von Addgene erhältliche Plasmide jetzt über vollständige Sequenzdaten verfügen, empfehlen wir, Gensequenzen direkt auf Codonoptimierung und Eignung für Ihren Expressionswirt zu analysieren, bevor Sie sie in Ihren Experimenten verwenden.
Expression alternativer tRNAs
Wenn Sie nicht die Zeit oder die Mittel haben, um eine codonoptimierte Version Ihres interessierenden Gens zu synthetisieren, ist es möglich, tRNAs mit geringer Häufigkeit in Ihrem Expressionswirt zu überexprimieren und dadurch ihre Häufigkeit zu erhöhen. Zum Beispiel exprimieren die kommerziellen Rosetta E. coli-Stämme eine Vielzahl von tRNAs, die normalerweise in geringer Häufigkeit in E. coli gefunden werden.
Der Vorteil der Produktion zusätzlicher tRNAs besteht darin, dass Sie dasselbe Expressionssystem für viele verschiedene Gene verwenden können, ohne neue Konstrukte erstellen zu müssen. Aufgrund von Problemen wie nicht übereinstimmenden Translationsraten und potenziellen Auswirkungen auf das Zellwachstum exprimieren jedoch selbst Wirte, die alternative tRNAs produzieren, möglicherweise nicht ausreichende Mengen Ihres Proteins von Interesse.
Unabhängig davon, welche Methode Sie wählen, um die Probleme der Codonwahl zu überwinden, sollten Sie über eine Methode verfügen, um sicherzustellen, dass die von Ihnen produzierten Proteine ordnungsgemäß funktionieren. Überexpression kann zur Produktion von unlöslichen, nicht funktionellen Proteinklumpen führen, die als Einschlusskörper bekannt sind und sich im Allgemeinen während der Reinigungsverfahren mit dem Zellpellet trennen. Selbst wenn Sie eine große Menge Protein in Ihrem Expressionswirt Ihrer Wahl produzieren, sollten Sie einen funktionellen Assay durchführen, um sicherzustellen, dass Ihr Protein keine Einschlusskörper bildet und sich richtig faltet.
1. In: Angov, Evelina, et al. „Die heterologe Proteinexpression wird verstärkt, indem die Codonnutzungsfrequenzen des Zielgens mit denen des Expressionswirts harmonisiert werden.“ PLoS one 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PubMed Zentrale PMCID: PMC2364656.
2. Dittmar, Kimberly A., et al. „Selektives Laden von tRNA-Isoakzeptoren, induziert durch Aminosäuremangel.“ EMBO reports 6.2 (2005): 151-157. PubMed PMID: 15678157. PubMed Zentrale PMCID: PMC1299251.
3. Emilsson, Valur, und Charles G. Kurland. „Wachstumsratenabhängigkeit der Transfer-RNA-Häufigkeit in Escherichia coli.“ Das EMBO Journal 9.13 (1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611. PubMed Zentrale PMCID: PMC552224.
4. Gustafsson, Claes, Sridhar Govindarajan, und Jeremy Minshull. „Codon Bias und heterologe Proteinexpression.“ Trends in der Biotechnologie 22.7 (2004): 346-353. PubMed PMID: 15245907.
5. Maertens, Barbara, et al. „Genoptimierungsmechanismen: Eine Multi-Gen-Studie zeigt eine hohe Erfolgsrate von humanen Proteinen in voller Länge, die in Escherichia coli exprimiert werden.“ Proteinwissenschaft 19.7 (2010): 1312-1326. PubMed PMID: 20506237. PubMed Zentrale PMCID: PMC2970903.
6. Pechmann, Sebastian, und Judith Frydman. „Die evolutionäre Erhaltung der Codon-Optimalität enthüllt verborgene Signaturen der cotranslationalen Faltung.“ Natur“ & Molekularbiologie20.2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PubMed Zentrale PMCID: PMC3565066.
7. Quax, Tessa EF, et al. „Codon Bias als Mittel zur Feinabstimmung der Genexpression.“ Molekulare Zelle 59.2 (2015): 149-161. PubMed PMID: 26186290. PubMed Zentrale PMCID: PMC4794256.
- Diese Rezension bietet einen großartigen Überblick über die Voreingenommenheit der Codonnutzung
8. Müller, Michael, et al. „Die Translationseffizienz wird sowohl durch Codon-Bias als auch durch Faltungsenergie bestimmt.“ Proceedings der Nationalen Akademie der Wissenschaften 107.8 (2010): 3645-3650. PubMed PMID: 20133581. PubMed Zentrale PMCID: PMC2840511.