Klassisch, um einen Radioimmunoassay durchzuführen, wird eine bekannte Menge eines Antigens radioaktiv gemacht, häufig durch Markierung mit gamma-radioaktiven Isotopen von Jod, wie 125-I, an Tyrosin gebunden. Dieses radioaktiv markierte Antigen wird dann mit einer bekannten Menge Antikörper für dieses Antigen gemischt, und als Ergebnis binden die beiden spezifisch aneinander. Dann wird eine Serumprobe von einem Patienten hinzugefügt, die eine unbekannte Menge desselben Antigens enthält. Dies bewirkt, dass das unmarkierte (oder „kalte“) Antigen aus dem Serum mit dem radioaktiv markierten Antigen („heiß“) um Antikörperbindungsstellen konkurriert. Wenn die Konzentration des „kalten“ Antigens erhöht wird, bindet mehr davon an den Antikörper, verdrängt die radioaktiv markierte Variante und verringert das Verhältnis von antikörpergebundenem radioaktiv markiertem Antigen zu freiem radioaktiv markiertem Antigen. Anschließend werden die gebundenen Antigene abgetrennt und die Radioaktivität des im Überstand verbliebenen freien (ungebundenen) Antigens mit einem Gammazähler gemessen.
Diese Methode kann prinzipiell für jedes biologische Molekül verwendet werden und ist nicht auf Serumantigene beschränkt, noch ist es erforderlich, die indirekte Methode zur Messung des freien Antigens anstelle der direkten Messung des eingefangenen Antigens zu verwenden. Wenn es beispielsweise unerwünscht oder nicht möglich ist, das interessierende Antigen oder Zielmolekül zu radioaktiv zu markieren, kann eine RIA durchgeführt werden, wenn zwei verschiedene Antikörper, die das Ziel erkennen, verfügbar sind und das Ziel groß genug ist (z. B. ein Protein), um den Antikörpern mehrere Epitope zu präsentieren. Ein Antikörper würde wie oben radioaktiv markiert, während der andere unverändert bleiben würde. Die RIA würde damit beginnen, dass der „kalte“ unmarkierte Antikörper interagieren und an das Zielmolekül in Lösung binden kann. Vorzugsweise ist dieser unmarkierte Antikörper in irgendeiner Weise immobilisiert, wie beispielsweise an eine Agarosekügelchen gekoppelt, auf eine Oberfläche beschichtet usw. Als nächstes wird dem „heißen“ radioaktiv markierten Antikörper erlaubt, mit dem ersten Antikörper-Zielmolekül-Komplex zu interagieren. Nach ausgiebigem Waschen wird die direkte Menge des gebundenen radioaktiven Antikörpers gemessen und die Menge des Zielmoleküls durch Vergleich mit einer gleichzeitig getesteten Referenzmenge quantifiziert. Diese Methode ähnelt im Prinzip der nicht-radioaktiven Sandwich-ELISA-Methode.