1 Einleitung
Gene für Transmembranproteine (TMPs) machen 20-30% der meisten Genome aus (Wallin & Heijne, 1998), und aufgrund ihrer kritischen Rolle in der Zellphysiologie sind TMPs die Ziele eines großen Teils klinisch nützlicher Medikamente. Daher ist die Bestimmung ihrer Strukturen und Wirkweisen von erheblicher Bedeutung. Die Anzahl der verfügbaren hochauflösenden TMP-Strukturen bleibt jedoch relativ gering (siehe Webseite von Stephen White; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Zwei Erklärungen, die häufig für die Schwierigkeit des Erhaltens von gut-beugenden Kristallen von TMPs für Gebrauch in den Röntgenstrahlbeugungsstudien angerufen werden, sind (1) TMPs sind strukturell dynamisch mit flexiblen Regionen, die es schwierig machen, damit das Protein die einheitliche Anpassung annimmt, die für Verpackung in einen Kristall erfordert wird; und (2) Oberflächen von transmembranen Regionen von TMPs nehmen nicht so bereitwillig wie die Oberflächen von kugelförmigen löslichen Proteinen an den Proteinproteinwechselwirkungen teil, die für Kristallverpackung erfordert werden. Die Einführung eines stabilen löslichen Proteins in eine oberflächenexponierte Region eines TMP bietet eine Möglichkeit, diese beiden Probleme möglicherweise zu umgehen, da eine solche Insertion an einer internen Stelle in einem TMP die Gesamtflexibilität verringern kann und da das Vorhandensein einer leicht kristallisierbaren löslichen Domäne intermolekulare Kontakte bereitstellen kann, die für die Kristallisation erforderlich sind (Chun et al., 2012; Engel, Chen, & Privé, 2002).
Die Fusion von T4-Lysozym (T4L) an internen Stellen in TMPs lieferte bisher einen erfolgreichen Ansatz zur Bestimmung der Strukturen diverser Mitglieder der wichtigen GPCR-Superfamilie (Cherezov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Fenalti et al., 2014; Granier et al., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola et al., 2008; Kruse et al., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Weiß et al., 2012; Wu et al., 2010, 2012; In: Xu et al., 2011; Zhang et al., 2012). Ähnliche innere Fusionen eines thermisch stabilisierten Apocytochroms b (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014) und rubredoxin (Tan et al., 2013) haben auch GPCR-Strukturen ergeben. Darüber hinaus wurden mehrere GPCR-Strukturen durch Kristallisation von Konstrukten erhalten, bei denen der stabilisierende Proteinpartner am N-Terminus der Rezeptorsequenz und nicht an einer internen Position fusioniert wurde (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thompson et al., 2012; Wu et al., 2014), was darauf hindeutet, dass die Rolle von Fusionsproteinen bei der Erleichterung der Bildung intermolekularer Kontakte für die Förderung der Kristallisation wichtiger sein kann als die Verringerung der TMP-Flexibilität. Alternative Ansätze zur Gewinnung von GPCR-Strukturen, die keine Verwendung von Fusionsproteinen beinhalten, haben die Kokristallisation mit Antirezeptor-Antikörpern (Kruse et al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et al., 2013) und die Kristallisation von GPCR-Varianten, die durch Einführung von Punktmutationen und Deletionen thermostabilisiert wurden (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). Tatsächlich haben die meisten fusionsproteinhaltigen GPCR-Varianten, die für eine erfolgreiche Strukturbestimmung verwendet werden, auch Punktmutationen und -kürzungen eingebaut, um die Proteinstabilität weiter zu verbessern und die Flexibilität zu verringern.
Insertion von stabilen löslichen Proteinen in TMPs zwecks Förderung der Kristallisation wurde im Allgemeinen als Insertion oder Ersatz für Reste in der dritten intrazellulären (IC3) Schleife von GPCR durchgeführt. Dies basiert auf der Erwartung, dass diese Region in Rezeptoren flexibel ist und die Relativbewegung der umgebenden Helices steuern kann (Rosenbaum et al., 2007) sowie die Verringerung der Wahrscheinlichkeit, dass die Insertion des Fusionspartners die gesamte GPCR-Struktur stört (Chun et al., 2012). Während solche Insertionen häufig die Gesamtstrukturen von Rezeptoren nicht stören (basierend auf der Beibehaltung zumindest einer gewissen Ligandenbindungsaffinität durch die Fusionskonstrukte), führen sie im Allgemeinen zu einem Verlust der Fähigkeit, das verwandte trimere G-Protein zu aktivieren (Rosenbaum et al., 2007), was nicht verwunderlich ist, da die IC3-Schleife häufig der Ort funktioneller Wechselwirkungen zwischen GPCRs und den trimeren G-Proteinen ist, die ihre unmittelbaren nachgeschalteten Effektoren sind. Darüber hinaus sind die Kriterien für die Festlegung bestimmter Verbindungsstellen für die Insertion von Fusionsproteinen und für die Bestimmung der Menge der Rezeptorsequenz, die sie ersetzen, nicht gut etabliert. Eine erfolgreiche Fusion muss eine optimale Übereinstimmung zwischen dem Abstand und der Orientierung der N- und C-Termini des insertierten Proteins und den Verbindungsstellen in der GPCR bieten (Chun et al., 2012; Engel et al., 2002). Daher kann die Schaffung einer nützlichen Fusion die Synthese oder Konstruktion mehrerer Versionen fusionierter Gene erfordern (Rosenbaum et al., 2007).
Wir beschreiben hier eine Strategie zur Generierung und zum Screening einer Bibliothek varianter Formen eines Rezeptors, der Insertionen von T4L an verschiedenen Punkten in der dritten intrazellulären (IC3) Schleife als Ersatz für unterschiedliche Anzahlen von Aminosäureresten in der Schleifensequenz enthält (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Durch die Expression von Rezeptoren in Hefe ist es möglich, randomisierte Bibliotheken von Varianten mit Lysozym-Insertionen zu erstellen und direkt nach Konstrukten mit maximalen Gesamtexpressionsniveaus, Anzahl der Ligandenbindungsstellen an der Zelloberfläche und sogar Rezeptorfunktion zu suchen, die basierend auf der Aktivierung des verwandten G-Proteins getestet wurden. Die Ansätze waren erfolgreich bei der Identifizierung von Rezeptoren mit Insertionen in der IC3-Schleife, die nahezu die volle Signalfunktion behalten. Dies deutet darauf hin, dass das T4L-Molekül, wenn es über geeignete Verknüpfungssequenzen gebunden wird, in diese Schleife eingefügt werden kann, ohne den Zugang des G-Proteins zu relevanten Oberflächen des aktivierten Rezeptors zu verhindern.
Die beschriebenen Protokolle wurden unter Verwendung von Ste2p entwickelt, einer endogenen GPCR der Hefe Saccharomyces cerevisiae, die als lenkbares Ausgangssystem verwendet wird, für das noch keine dreidimensionale Struktur verfügbar ist. Ähnliche Ansätze könnten jedoch verwendet werden, um Insertion-haltige Varianten der zahlreichen Säugetier-GPCRs zu identifizieren, von denen berichtet wurde, dass sie in der Lage sind, den Hefe-Pheromon-Antwortweg zu aktivieren (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), oder zu anderen TMPs, für die ein Funktionstest in intakten Zellen möglich ist. Weiterhin wurden Hefespezies als Expressionssysteme zur Strukturbestimmung von GPCR und anderen TMPs eingesetzt (Clark et al., 2010), u.a. zur Bestimmung der Kristallstruktur des humanen H1-Histaminrezeptors (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p ist der Rezeptor für das Hefe-Paarungspheromon α-Faktor, ein Peptid mit 13 Rückständen. Die Bindung dieses Liganden führt zur Aktivierung eines cytoplasmatischen heterotrimeren G-Proteins, das wiederum einen MAP-Kinase-Weg aktiviert, was letztendlich zu Transkriptionsreaktionen, Veränderungen der Zellform, Zellzyklusstillstand und Fusion mit Hefezellen des entgegengesetzten Paarungstyps führt.