2- Die D-Elektrophorese beginnt mit der Elektrophorese in der ersten Dimension und trennt dann die Moleküle senkrecht von der ersten, um ein Elektropherogramm in der zweiten Dimension zu erzeugen. Bei der Elektrophorese in der ersten Dimension werden Moleküle linear nach ihrem isoelektrischen Punkt getrennt. In der zweiten Dimension werden die Moleküle dann bei 90 Grad vom ersten Elektropherogramm nach Molekülmasse getrennt. Da es unwahrscheinlich ist, dass zwei Moleküle in zwei verschiedenen Eigenschaften ähnlich sind, werden Moleküle bei der 2-D-Elektrophorese effektiver getrennt als bei der 1-D-Elektrophorese.
Die beiden Dimensionen, in die Proteine mit dieser Technik getrennt werden, können isoelektrischer Punkt, Proteinkomplexmasse im nativen Zustand oder Proteinmasse sein.
Die Trennung der Proteine durch den isoelektrischen Punkt wird als isoelektrische Fokussierung (IEF) bezeichnet. Dabei wird ein pH-Gradient an ein Gel angelegt und ein elektrisches Potential wird über das Gel angelegt, wodurch ein Ende positiver als das andere wird. Bei allen pH-Werten außer ihrem isoelektrischen Punkt werden Proteine geladen. Wenn sie positiv geladen sind, werden sie zum negativeren Ende des Gels gezogen, und wenn sie negativ geladen sind, werden sie zum positiveren Ende des Gels gezogen. Die in der ersten Dimension aufgebrachten Proteine bewegen sich entlang des Gels und sammeln sich an ihrem isoelektrischen Punkt an. das heißt, der Punkt, an dem die Gesamtladung des Proteins 0 ist (eine neutrale Ladung).
Für die Analyse der Funktionsweise von Proteinen in einer Zelle ist die Kenntnis ihrer Kooperation essentiell. Meistens wirken Proteine in Komplexen zusammen, um voll funktionsfähig zu sein. Die Analyse dieser suborganellen Organisation der Zelle erfordert Techniken, die den nativen Zustand der Proteinkomplexe erhalten. Bei der nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (native PAGE) verbleiben Proteine in ihrem nativen Zustand und werden im elektrischen Feld nach ihrer Masse bzw. der Masse ihrer Komplexe getrennt. Um eine Trennung nach Größe und nicht wie bei IEF nach Nettoladung zu erhalten, wird durch Verwendung von Coomassie Brilliant Blue oder Lithiumdodecylsulfat eine zusätzliche Ladung auf die Proteine übertragen. Nach Beendigung der ersten Dimension werden die Komplexe durch Aufbringen der denaturierenden SDS-PAGE in der zweiten Dimension zerstört, wobei die Proteine, aus denen die Komplexe bestehen, durch ihre Masse getrennt werden.
Vor der Massentrennung der Proteine werden diese zusammen mit anderen Reagenzien mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt (SDS-PAGE in 1-D). Dies denaturiert die Proteine (das heißt, es entfaltet sie in lange, gerade Moleküle) und bindet eine Anzahl von SDS-Molekülen, die ungefähr proportional zur Länge des Proteins sind. Da die Länge eines Proteins (wenn es entfaltet ist) ungefähr proportional zu seiner Masse ist, entspricht dies der Aussage, dass es eine Anzahl von SDS-Molekülen bindet, die ungefähr proportional zur Masse des Proteins sind. Da die SDS-Moleküle negativ geladen sind, hat dies zur Folge, dass alle Proteine ungefähr das gleiche Masse-zu-Ladungs-Verhältnis haben. Darüber hinaus wandern Proteine nicht, wenn sie keine Ladung haben (ein Ergebnis des isoelektrischen Fokussierungsschritts). Daher ermöglicht die Beschichtung des Proteins in SDS (negativ geladen) die Migration der Proteine in der zweiten Dimension (SDS-PAGE, es ist nicht kompatibel für die Verwendung in der ersten Dimension, da es geladen ist und ein nichtionisches oder zwitterionisches Detergens verwendet werden muss).In der zweiten Dimension wird erneut ein elektrisches Potential angelegt, jedoch in einem Winkel von 90 Grad vom ersten Feld. Die Proteine werden proportional zu ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis von der positiveren Seite des Gels angezogen (da SDS negativ geladen ist). Wie bereits erläutert, wird dieses Verhältnis für alle Proteine nahezu gleich sein. Der Fortschritt der Proteine wird durch Reibungskräfte verlangsamt. Das Gel wirkt daher beim Anlegen des Stroms wie ein Molekularsieb, das die Proteine aufgrund ihres Molekulargewichts trennt, wobei größere Proteine höher im Gel zurückgehalten werden und kleinere Proteine das Sieb passieren und niedrigere Bereiche des Gels erreichen können.