Attività e specificità
DPP8 e DPP9 hanno substrato molto simile e inibitore specificità. Poiché molti degli inibitori DPPIV utilizzati prima sembrano anche inibire DPP8 e DPP9, è possibile che questi enzimi siano responsabili di alcune delle funzioni attribuite a DPPIV.
Come DPPIV e DPP8, DPP9 preferisce Pro nella posizione P1 dei substrati sintetici . Con Pro fissato a P1, (X-Pro-NHPhNO2) i residui più favoriti da DPP9 (e DPP8) nella posizione P2 sono residui idrofobici e basici e i meno favoriti sono residui acidi (Arg/Met/Leu/Lys>>Ala/Ser/Gly>>Glu/Asp/Asn). La maggior parte dei dati finora disponibili indicano che l’Arg-Pro-NHPhNO2 di base è un substrato preferibile in termini di affinità. Il tasso di turnover, al contrario, è molto più lento rispetto ad Ala-Pro – e Gly-Pro-NHPhNO2 . Questo è in contrasto con la specificità del substrato molto meno discriminante di DPPIV. La scissione di Val-Ala-NHPhNO2 da DPP9892aa era meno efficiente dei substrati con Pro a P1 e Gly-Gly -, Ala-Ala – e Ala-Phe-NHPhNO2 non erano idrolizzati .
DPP9 ha idrolizzato i substrati fluorogenici Ala-Pro-7-amino-3-trifluorometilcumarina (- AFC) e Ala-Pro -, Gly-Pro -, Lys-Pro -, Trp-Pro -, Val-Pro-e Asp-Pro-AMC . Per quanto riguarda i substrati cromogenici-NHPhNO2, Asp-Pro-AMC è stato il substrato meno preferito per DPP9 in questa serie.
DPP8 e DPP9 mostrano cinetiche di Michaelis-Menten molto simili. Tuttavia, le efficienze catalitiche verso i loro substrati sono generalmente inferiori a quelle del DPPIV. Quando si confrontano i dati della letteratura sui parametri catalitici, si osservano più discrepanze tra i diversi studi per DPP8 e DPP9 rispetto al caso per DPPIV. A causa dell’ampia disponibilità, i substrati cromogenici e fluorogenici contenenti Ala-Pro e Gly – Pro sono più spesso utilizzati per determinare l’attività di DPP9. Nei campioni biologici, è obbligatorio includere uno specifico inibitore del DPPIV per eliminare l’interferenza del DPPIV nelle analisi .
Usando Ala-Phe-Pro-NHPhNO2, Ala-Ala-Pro-NHPhNO2, Ala-Ala-Ala-NHPhNO2 e Z-Gly-Pro-NHPhNO2 come substrati, rDPP9 non ha attività tripeptidasi ed endopeptidasi . La deplezione di DPP8 o DPP9 nelle cellule con siRNA non ha avuto alcun effetto sulla scissione di Arg-, Ala-Ala-Phe – e Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC . L’attività massima di DPP9 su substrati cromogenici e fluorogenici derivati da dipeptidi è stata osservata nell’intervallo di pH pH 7,4–8,5 . Sotto pH 6.3 – 6.5 è stata rilevata poca attività di DPP9 sia ricombinante che naturale. Il pH neutro ottimale supporta la localizzazione citoplasmatica.
Alcuni inibitori inizialmente progettati per DPPIV inibiscono anche l’attività di DPP8 / 9. I peptidi dell’acido boronico, incluso Val-boroPro, noto anche come Talabostat, hanno dimostrato di essere potenti inibitori di una varietà di proteasi selettive di tipo serinico della prolina (DPPII, DPPIV, DPP8, DPP9 e FAP) . Allo-isoleucil tiazolidina, Lys(Z-(NO2))pirrolidina e Lys(Z-(NO2))tiazolidina sono risultati leggermente più selettivi verso DPP8/9 rispetto a DPPIV . Una serie di α-amminoacil-((2S,4S)-4-azido-2-cianopirrolidine) ha portato a composti con valori Ki nell’intervallo nanomolare per DPP8/9 e una modesta selettività complessiva verso DPPIV e DPPII .
La sostituzione dell’anello tiazolidinico di allo-isoleucil tiazolidina con una porzione di isoindolina ha aumentato l’inibizione di DPP8 e DPP9, mentre l’inibizione di DPPIV è stata significativamente ridotta . Jiaang et al. scoperti inibitori selettivi DPP8/9 contenenti un’isoindolina a P1. Isoindolina con 1 – (4,4 ‘ – difluorobenzidril)piperazina nel sito P2 (1G244; PTX1210) è un inibitore molto potente e selettivo di DPP8 / 9. 1G244 ha valori IC50 di 14 e 53 nM contro DPP8 e DPP9, rispettivamente . Con valori IC50 superiori a 100 µM, si può concludere che 1G244 non inibisce significativamente DPPIV, FAP o DPPII. È interessante notare che è un inibitore competitivo legante lento-stretto di DPP8, ma il composto si comporta come un inibitore competitivo e reversibile di DPP9 . In contrasto con allo -le-isoindolina, 1G244 penetrato la membrana plasmatica e non ha causato sintomi tossicologici significativi nei ratti . In un’altra serie di mimetici di isoindolina,il composto (2S, 3R)-2-amino-1-(5-fluoroisoindolin-2-il)-3-methylpentan-1-one ha mostrato il miglior equilibrio di potenza e selettività. Sebbene il suo potenziale inibitorio verso DPP8 fosse simile a quello della struttura genitore, c’era un modesto, quadruplo aumento di potenza verso DPP9 rispetto a DPP8 . Fino ad ora, non ci sono inibitori segnalati la cui affinità per DPP8 e DPP9 differisce più di dieci volte.
Mantenendo la struttura a base di dipeptidi e introducendo una frazione di diaril fosfonato nella posizione P1, sono stati sviluppati inibitori irreversibili di DPP8/9. I derivati di bis(4-acetamidofenil)pirrolidin-2-il e isoindolin-1-il con un residuo dibasico di lisina P2 erano potenti inibitori per DPP8/9. Un certo numero di inibitori derivati da isoindolina in questa serie ha dimostrato di combinare una buona affinità e una selettività pronunciata per DPP8 e DPP9 per quanto riguarda DPPIV e DPPII .