2 Topi transgenici R6/2
La linea R6 è stata sviluppata nei laboratori di Gill Bates da un’iniezione pronucleare di un frammento Sacl-EcoRI da 1,9 kb utilizzando l’estremità 5′ del gene umano MH derivato da un paziente MH. È composto da sequences 1 kb di sequenze UTR da 5′, esone 1 che porta ripetizioni CAG di units 130 unità e i primi 262 bp di intron 1. La linea R6 / 2 è stato il primo modello di topo transgenico di HD. Ha una dimensione di picco di 144-150 unità di ripetizione all’esone 1 (Mangiarini et al., 1996). Si tratta di uno dei modelli genetici più utilizzati della MH. Il modello R6 / 2 presenta un fenotipo progressivo omogeneo simile all’HD, con una sopravvivenza che varia da 14 a 21 settimane, a seconda delle condizioni abitative e della struttura. Le differenze nella durata della sopravvivenza possono essere il risultato di variazioni nell’alloggiamento, nella manipolazione, nell’arricchimento ambientale e nella presenza ammissibile di simbionti virali e batterici, oltre ad altri fattori. Dato che gli ambienti arricchiti possono alterare la progressione del fenotipo comportamentale nei topi R6/2 (Hannan, 2004), è ovvio che le differenze tra i laboratori potrebbero alterare il fenotipo R6/2. I topi R6 / 2 attualmente disponibili nei vivari commerciali hanno una ripetizione CAG molto inferiore rispetto a quelli precedentemente utilizzati negli studi sperimentali. Le questioni di cui sopra mandano che, all’interno di qualsiasi colonia di topi R6/2, la dimensione di ripetizione CAG è fondamentale per qualsiasi risultato e una misurazione ripetibile della sopravvivenza e altre misure di esito fenotipico sono fondamentali per ogni generazione successiva “f” per il confronto con altri studi.
Analisi comportamentali delle menomazioni correlate allo showage del topo R6/2 nei movimenti distonici, nelle prestazioni motorie, nella forza di presa e nel peso corporeo che peggiorano progressivamente fino alla morte. I topi R6/2 sono soggetti ad attività convulsiva (stato epilettico) e morte improvvisa, in particolare nella malattia allo stadio terminale, sebbene le convulsioni possano verificarsi già a 60 giorni. La gestione eccessiva e altri fattori di stress esacerbano l’attività convulsiva. Le sequele neuropatologiche che includono l’aumento delle riduzioni marcate del peso cerebrale, sono presenti da 30 giorni, mentre il volume cerebrale diminuito e l’allargamento iperventricolare sono presenti da 60 giorni, entrambi un segno distintivo della malattia umana. Inoltre, diminuzione del volume neostriatale, atrofia neuronale striatale, aumento dell’astrogliosi e una riduzione del numero di neuroni striatali, sono presenti a 90 giorni di età (Stack et al., 2005). Inoltre, coerentemente con la MH precoce ad esordio adulto, i neuroni striatali dell’encefalina sono ridotti rispetto ai neuroni di proiezione striatale della sostanza-P (Sun et al., 2002) con uguale conservazione dell’encefalina e delle proiezioni striatonigrali della sostanza-P. Gli aggregati huntingtina-positivi sono presenti al giorno 1 postnatale e aumentano di numero e dimensioni con l’età, suggerendo che l’insorgenza e la progressione della malattia si verificano prima della presenza di fenomeni clinici (Stack et al., 2005). Le inclusioni di huntingtina sono estese e si trovano in gran numero in tutto il cervello, un fenomeno che non è coerente con quello osservato nei pazienti MH. È stato suggerito che quest’ultimo potrebbe essere il risultato dell’uso solo di una parte del gene MH, degli effetti del transgene e/o dell’uso di promotori stranieri che aumentano i livelli di espressione. Non sembra esserci alcuna differenza di genere nel fenotipo patologico. C’è un parallelismo tra i segnalati meccanismi della patogenesi della malattia osservata in pazienti HD e quelli che si trovano in topi R6/2, che includono alterata la proteolisi e proteosomal attività, aumento della proteina di reticolazione, indotta chaperone espressione, e i difetti vitale processi cellulari che compongono endocitosi, intraneuronali traffico, regolazione trascrizionale, post-sinaptica segnalazione apoptotic cascate, e le alterazioni nel metabolismo bioenergetico e la funzione mitocondriale (Beal e Ferrante, 2004; Ryu et al., 2005; Stack e Ferrante, 2007). Mentre il modello R6 / 2 ha molte delle caratteristiche cliniche e neuropatologiche osservate nei pazienti MH, non è una corrispondenza genetica e neuropatologica esatta con i pazienti MH. Tuttavia, il modello R6 / 2 ha un fenotipo progressivo ben caratterizzato con variabilità moderata, tale che i gruppi sperimentali possono contenere fino a 10 topi e fornire il potere di rilevare le differenze in molte misure di risultato. È possibile eseguire studi di sopravvivenza, un importante indicatore potenziale surrogato per la neuroprotezione, in circa 3 mesi dalla nascita. L’efficienza e gli endpoint sperimentali chiari dei topi R6/2 rimangono un vantaggio importante.
Può esserci una grande variabilità nella presentazione del fenotipo, che dipende dalla dimensione della ripetizione CAG. Il numero di ripetizioni CAG nella linea R6/2 è 148-153 con 500-550 bp, come determinato dall’analisi PCR (Stack et al., 2005). Un aumento del numero di coppie di basi >550 determina una moderazione della gravità del fenotipo R6 / 2. Con l’aumento dei numeri di coppia di base, vi è un concomitante aumento delle dimensioni di ripetizione CAG. Coppie di basi comprese tra 600 e 800 hanno dimensioni di ripetizione CAG tra 175 e 192 nei topi R6/2 e l’estensione media della sopravvivenza aumenta significativamente a circa 131 giorni, in contrasto con 500-550 bp a 98 giorni. I numeri delle coppie di base di 1000 e superiori hanno dimensioni di ripetizione CAG costantemente superiori a 200, con una sopravvivenza media di 148 giorni. La variabilità nella sopravvivenza e il miglioramento del fenotipo comportamentale e neuropatologico nei topi R6/2 con un aumento del numero di coppie di basi e delle dimensioni di ripetizione CAG possono ridurre la loro utilità negli studi terapeutici e possono confondere i risultati sperimentali (Stack et al., 2005). Sebbene la grande variabilità nelle misure cliniche sia comune nelle prove umane, minimizzando la variabilità di misura aumenti il potere di individuare le differenze, particolarmente nelle prove della droga del topo. Pertanto i laboratori che utilizzano questi topi dovrebbero garantire che la variabilità genetica sia ridotta, fornendo una popolazione relativamente omogenea di topi all’interno di coorti sperimentali.