2-D l’elettroforesi inizia con l’elettroforesi nella prima dimensione e quindi separa le molecole perpendicolarmente dalla prima per creare un elettroferogramma nella seconda dimensione. Nell’elettroforesi nella prima dimensione, le molecole sono separate linearmente in base al loro punto isoelettrico. Nella seconda dimensione, le molecole vengono quindi separate a 90 gradi dal primo elettroferogramma in base alla massa molecolare. Poiché è improbabile che due molecole siano simili in due proprietà distinte, le molecole sono separate in modo più efficace nell’elettroforesi 2-D rispetto all’elettroforesi 1-D.
Le due dimensioni che le proteine sono separate in usando questa tecnica possono essere punto isoelettrico, massa complessa della proteina nello stato nativo, o massa della proteina.
La separazione delle proteine dal punto isoelettrico è chiamata messa a fuoco isoelettrica (IEF). In tal modo, un gradiente di pH viene applicato a un gel e un potenziale elettrico viene applicato attraverso il gel, rendendo un’estremità più positiva dell’altra. A tutti i valori di pH diversi dal loro punto isoelettrico, le proteine saranno caricate. Se sono caricati positivamente, saranno tirati verso l’estremità più negativa del gel e se sono caricati negativamente saranno tirati verso l’estremità più positiva del gel. Le proteine applicate nella prima dimensione si muoveranno lungo il gel e si accumuleranno nel loro punto isoelettrico; cioè, il punto in cui la carica complessiva sulla proteina è 0 (una carica neutra).
Per l’analisi del funzionamento delle proteine in una cellula, la conoscenza della loro cooperazione è essenziale. Molto spesso le proteine agiscono insieme in complessi per essere pienamente funzionali. L’analisi di questa organizzazione sub organellare della cellula richiede tecniche di conservazione dello stato nativo dei complessi proteici. Nell’elettroforesi su gel di poliacrilammide nativa (pagina nativa), le proteine rimangono nel loro stato nativo e sono separate nel campo elettrico seguendo rispettivamente la loro massa e la massa dei loro complessi. Per ottenere una separazione per dimensione e non per carica netta, come in IEF, un costo aggiuntivo viene trasferito alle proteine mediante l’uso di Coomassie Brilliant Blue o litio dodecil solfato. Dopo il completamento della prima dimensione i complessi vengono distrutti applicando la denaturazione SDS-PAGE nella seconda dimensione, dove le proteine di cui sono composti i complessi sono separate dalla loro massa.
Prima di separare le proteine in massa, vengono trattate con sodio dodecil solfato (SDS) insieme ad altri reagenti (SDS-PAGE in 1-D). Questo denatura le proteine (cioè, le dispiega in molecole lunghe e diritte) e lega un numero di molecole SDS approssimativamente proporzionali alla lunghezza della proteina. Poiché la lunghezza di una proteina (quando spiegata) è approssimativamente proporzionale alla sua massa, ciò equivale a dire che attacca un numero di molecole SDS approssimativamente proporzionali alla massa della proteina. Poiché le molecole SDS sono caricate negativamente, il risultato di ciò è che tutte le proteine avranno approssimativamente lo stesso rapporto massa-carica l’una dell’altra. Inoltre, le proteine non migrare quando non hanno alcuna carica (un risultato di focalizzazione isoelettrica passo) quindi il rivestimento della proteina in SDS (carica negativa) consente di eseguire la migrazione delle proteine nella seconda dimensione (SDS-PAGE, non è compatibile per l’utilizzo nella prima dimensione, come si paga e non ionici o zwitterionici detergente deve essere utilizzato).Nella seconda dimensione, un potenziale elettrico è ancora applicata, ma a un angolo di 90 gradi dal primo campo. Le proteine saranno attratte dal lato più positivo del gel (perché SDS è caricato negativamente) proporzionalmente al loro rapporto massa-carica. Come spiegato in precedenza, questo rapporto sarà quasi lo stesso per tutte le proteine. Il progresso delle proteine sarà rallentato dalle forze di attrito. Il gel agisce quindi come un setaccio molecolare quando viene applicata la corrente, separando le proteine in base al loro peso molecolare con proteine più grandi trattenute più in alto nel gel e proteine più piccole in grado di passare attraverso il setaccio e raggiungere le regioni inferiori del gel.