Cromatografía de filtración de gel

Aplicaciones de Cromatografía de filtración de gel

La cromatografía de filtración de gel, un tipo de cromatografía de exclusión de tamaño, se puede usar para fraccionar moléculas y complejos en una muestra en fracciones con un rango de tamaño particular, para eliminar todas las moléculas más grandes que un tamaño particular de la muestra, o una combinación de ambas operaciones. La cromatografía de filtración de gel se puede usar para separar compuestos como moléculas pequeñas, proteínas, complejos de proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos cuando se encuentran en solución acuosa. Cuando se utiliza un solvente orgánico como fase móvil, el proceso se conoce como cromatografía de permeación de gel.

La cromatografía de filtración de gel también se puede utilizar para:

• Fraccionamiento de moléculas y complejos dentro de un rango de tamaño predeterminado
• Análisis y determinación de tamaño
• Eliminación de proteínas y complejos grandes
• Intercambio de tampones
• Desalación
• Eliminación de moléculas pequeñas como nucleótidos, imprimaciones, colorantes y contaminantes
• Evaluación de la pureza de la muestra
• Separación de radioisótopos unidos y no unidos

Los medios de cromatografía de filtración en gel para todos los usos anteriores están disponibles en columnas de flujo gravitatorio preenvasadas, columnas de espín, columnas de cromatografía de media presión y resinas embotelladas.

Mecanismo de cromatografía de filtración de gel

En una columna de cromatografía de filtración de gel, la fase estacionaria se compone de una matriz porosa, y la fase móvil es el tampón que fluye entre las perlas de la matriz. Las cuentas tienen un rango de tamaño de poro definido, conocido como el rango de fraccionamiento. Las moléculas y complejos que son demasiado grandes para entrar en los poros permanecen en la fase móvil y se mueven a través de la columna con el flujo del tampón. Las moléculas y los complejos más pequeños que son capaces de moverse en los poros entran en la fase estacionaria y se mueven a través de la columna de filtración de gel por un camino más largo a través de los poros de las perlas.

Cualquier molécula o complejo que esté por encima del rango de fraccionamiento para una columna de cromatografía de filtración de gel en particular se moverá a través de la columna más rápido que cualquier molécula que pueda entrar en la fase estacionaria. Por lo tanto, cualquier componente de la muestra que esté por encima del rango de fraccionamiento se eluirá primero (en el volumen vacío) antes que cualquier elemento que esté en el rango de fraccionamiento. El tamaño mínimo que permanecerá en la fase móvil y no entrará en la fase estacionaria se conoce como límite de exclusión. Bio-Rad ofrece medios y columnas de cromatografía de filtración de gel con límites de exclusión de más de tres órdenes de magnitud, desde 100 daltons hasta 100.000 daltons (100 kDa).

Las moléculas y los complejos que pueden entrar en la fase estacionaria se fraccionarán de acuerdo con sus tamaños. Las moléculas más pequeñas migrarán profundamente en los poros y se retardarán más que las moléculas más grandes que no entran tan fácilmente en los poros, y por lo tanto se elutan de la columna más rápidamente. Esta diferencia en la migración de poros conduce al fraccionamiento de componentes por tamaño, con la mayor elución en primer lugar.

En columnas de cromatografía de filtración de gel diseñadas para desalar, intercambiar tampones y eliminar moléculas pequeñas como nucleótidos, las sales y los compuestos pequeños ingresan fácilmente a los poros, se retardan y migran más lentamente a través de la columna que las proteínas más grandes o los ácidos nucleicos. Por lo tanto, los componentes de interés en la muestra se eluyen antes de sales, nucleótidos, etc. Los kits de limpieza de ADN que utilizan este mecanismo a menudo contienen columnas giratorias de filtración de gel.

La resolución, aquí definida como la nitidez de los límites entre fracciones de tamaño, está determinada por el tamaño del cordón y una serie de otros factores. El tamaño de cordón más pequeño generalmente produce una resolución más alta en una columna de cromatografía de filtración de gel. Las moléculas compactas se difunden a través de la fase estacionaria más rápido que las moléculas lineales. La exclusión de tamaño, el rango de fraccionamiento y la tasa de elución se ven afectados por la composición del tampón, la fuerza iónica y el pH. Para el fraccionamiento de mezclas complejas de proteínas, es posible que sea necesario determinar empíricamente los tiempos de elución y los límites de exclusión de tamaño.

Medios de cromatografía de filtración de gel

Un criterio importante para los medios de cromatografía de filtración de gel es que los medios son inertes y que nada en la muestra o ningún tampón se une a los medios. Otra consideración es el tipo de columna de filtración de gel que se utiliza y si se utiliza en un sistema de cromatografía presurizada o en columnas de flujo gravitatorio o centrifugado. Si se utiliza un sistema de cromatografía presurizada, tanto la columna como el medio deben ser capaces de tolerar la presión y los caudales utilizados.

Los medios comúnmente utilizados para la cromatografía de filtración de gel se basan en perlas de agarosa o poliacrilamida, dextrosa para sistemas de gravedad o baja presión y resinas poliméricas para sistemas de media presión. La elección del medio depende de las propiedades de los componentes a separar y de otros factores experimentales. Las siguientes son consideraciones generales al determinar la elección de medios de cromatografía de filtración de gel:

• Rango de fraccionamiento
• Límite de exclusión de tamaño
• Presión de funcionamiento
• Caudal
• Viscosidad de la muestra
• Rango de pH
• Esterilidad en autoclave
• Tolerancia para agua-disolventes orgánicos miscibles; algunas muestras pueden ser más solubles en una mezcla de agua orgánica
• Tolerancia a detergentes, agentes chaotrópicos, formamida, etc.
• Temperatura de funcionamiento

Los tipos de muestras, la elección del medio y la configuración del sistema de cromatografía determinarán qué parámetros son los más importantes para una aplicación de purificación determinada.