Actividad y especificidad
DPP8 y DPP9 tienen especificidad de sustrato e inhibidor muy similar. Como muchos de los inhibidores de DPPIV utilizados anteriormente también parecen inhibir DPP8 y DPP9, es posible que estas enzimas sean responsables de algunas de las funciones atribuidas a DPPIV.
Al igual que DPPIV y DPP8, DPP9 prefiere Pro en la posición P1 de los sustratos sintéticos . Con Pro fijo en P1, (X-Pro-NHPhNO2) los residuos más favorecidos por DPP9 (y DPP8) en la posición P2 son residuos hidrofóbicos y básicos, y los menos favorecidos son residuos ácidos (Arg/Met/Leu/Lys>>Ala/Ser/Gly>>Glu/Asp/Asn). La mayoría de los datos disponibles hasta ahora indican que el Arg-Pro-NHPhNO2 básico es un sustrato preferible en términos de afinidad. La tasa de rotación, en cambio, es mucho más lenta en comparación con Ala-Pro y Gly – Pro-NHPhNO2 . Esto contrasta con la especificidad de sustrato mucho menos discriminativa de DPPIV. La escisión de Val-Ala-NHPhNO2 por DPP9892aa fue menos eficiente que los sustratos con Pro at P1 y no se hidrolizaron Gly-Gly-, Ala-Ala – y Ala-Phe-NHPhNO2 .
DPP9 hidrolizó los sustratos fluorogénicos Ala-Pro-7-amino-3-trifluorometilcumarina (- AFC) y Ala-Pro, Gly-Pro, Lys-Pro, Trp-Pro, Val-Pro y Asp-Pro-AMC . En cuanto a los sustratos cromogénicos de NHPhNO2, Asp-Pro-AMC fue el sustrato menos preferido para DPP9 en esta serie.
DPP8 y DPP9 muestran cinéticas de Michaelis-Menten muy similares. Sin embargo, las eficiencias catalíticas hacia sus sustratos son generalmente más bajas que las de DPPIV. Al comparar los datos de la literatura sobre los parámetros catalíticos, se observan más discrepancias entre los diversos estudios para DPP8 y DPP9 que en el caso de DPPIV. Debido a la amplia disponibilidad, los sustratos cromogénicos y fluorogénicos que contienen Ala-Pro y Gly – Pro se usan con mayor frecuencia para determinar la actividad de DPP9. En muestras biológicas, es obligatorio incluir un inhibidor específico de DPPIV para eliminar la interferencia de DPPIV en los ensayos .
Utilizando Ala-Phe-Pro-NHPhNO2, Ala-Ala-Pro-NHPhNO2, Ala-Ala-Ala-NHPhNO2 y Z-Gly-Pro-NHPhNO2 como sustratos, rDPP9 carece de actividad tripeptidasa y endopeptidasa . La depleción de DPP8 o DPP9 en células con ARNip no tuvo efecto en la escisión de Arg, Ala-Ala-Phe y Suc-Leu – Leu-Val-Tyr-AMC . La actividad máxima de DPP9 en sustratos cromogénicos y fluorogénicos derivados de dipéptidos se observó en el rango de pH pH 7,4–8,5 . Por debajo de pH 6,3-6,5 se detectó poca actividad de DPP9 recombinante y natural. El pH neutro óptimo apoya la localización citoplasmática.
Algunos inhibidores diseñados inicialmente para DPPIV también inhiben la actividad DPP8/9. Los péptidos de ácido borónico, incluido el Val-boroPro, también conocido como Talabostato, demostraron ser inhibidores potentes de una variedad de proteasas de tipo serina selectivas de prolina (DPPII, DPPIV, DPP8, DPP9 y FAP) . Alo-isoleucil tiazolidina, Lis(Z-(NO2))pirrolidina y Lis(Z – (NO2))tiazolidina fueron ligeramente más selectivos hacia DPP8/9 que hacia DPPIV . Una serie de α-aminoacil-((2S,4S)-4-azido-2-cianopirrolidinas) resultó en compuestos con valores de Ki en el rango nanomolar para DPP8/9 y una modesta selectividad general hacia DPPIV y DPPII .
La sustitución del anillo tiazolidina de alo-isoleucil tiazolidina por un grupo de isoindolina aumentó la inhibición de DPP8 y DPP9, mientras que la inhibición de DPPIV disminuyó significativamente . Jiaang et al. inhibidores selectivos descubiertos de DPP8 / 9 que contienen una isoindolina en P1. Isoindolina con una 1 – (4,4 ‘ – difluorobenzidril)piperazina en el sitio P2 (1G244; PTX1210) es un inhibidor muy potente y selectivo de la DPP8 / 9. 1G244 tiene valores de IC50 de 14 y 53 nM frente a DPP8 y DPP9, respectivamente . Con valores de CI50 superiores a 100 µM, se puede concluir que 1G244 no inhibe significativamente DPPIV, FAP o DPPII. Curiosamente, es un inhibidor competitivo de unión lenta y ajustada de DPP8, pero el compuesto se comporta como un inhibidor competitivo y reversible de DPP9 . A diferencia de la alo-Ile-isoindolina, 1G244 penetró en la membrana plasmática y no causó síntomas toxicológicos significativos en ratas . En otra serie de miméticos de isoindolina, el compuesto (2S, 3R)-2-amino-1-(5-fluoroisoindolin-2-il)-3-metilpentan-1-one mostró el mejor equilibrio de potencia y selectividad. Aunque su potencial inhibitorio hacia DPP8 fue similar al de la estructura parental, hubo un aumento modesto y cuádruple en la potencia hacia DPP9 en comparación con DPP8 . Hasta ahora, no se han notificado inhibidores cuya afinidad por DPP8 y DPP9 difiere más de diez veces.
Al mantener la estructura a base de dipéptidos e introducir una fracción de fosfonato de diarilo en la posición P1, se desarrollaron inhibidores irreversibles de DPP8 / 9. Los derivados del bis(4-acetamidofenil)pirrolidin-2-il y del isoindolin-1-il con un residuo dibásico de lisina P2 fueron inhibidores potentes de la DPP8/9. Varios inhibidores derivados de la isoindolina de esta serie demostraron combinar una buena afinidad y una marcada selectividad para DPP8 y DPP9 con respecto a DPPIV y DPPII .