2-D La electroforesis comienza con la electroforesis en la primera dimensión y luego separa las moléculas perpendicularmente de la primera para crear un electroforograma en la segunda dimensión. En la electroforesis en la primera dimensión, las moléculas se separan linealmente de acuerdo con su punto isoeléctrico. En la segunda dimensión, las moléculas se separan a 90 grados del primer electroferograma de acuerdo con la masa molecular. Dado que es poco probable que dos moléculas sean similares en dos propiedades distintas, las moléculas se separan de manera más efectiva en la electroforesis 2D que en la electroforesis 1D.
Las dos dimensiones en las que se separan las proteínas usando esta técnica pueden ser el punto isoeléctrico, la masa compleja de proteínas en el estado nativo o la masa de proteínas.
La separación de las proteínas por punto isoeléctrico se denomina enfoque isoeléctrico (FEI). De este modo, se aplica un gradiente de pH a un gel y se aplica un potencial eléctrico a través del gel, haciendo que un extremo sea más positivo que el otro. En todos los valores de pH que no sean su punto isoeléctrico, las proteínas se cargarán. Si están cargados positivamente, serán tirados hacia el extremo más negativo del gel y si están cargados negativamente serán tirados hacia el extremo más positivo del gel. Las proteínas aplicadas en la primera dimensión se moverán a lo largo del gel y se acumularán en su punto isoeléctrico; es decir, el punto en el que la carga total de la proteína es 0 (una carga neutra).
Para el análisis del funcionamiento de las proteínas en una célula, el conocimiento de su cooperación es esencial. La mayoría de las veces, las proteínas actúan juntas en complejos para ser completamente funcionales. El análisis de esta organización sub orgánulos de la célula requiere técnicas que conserven el estado nativo de los complejos proteicos. En la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa( página nativa), las proteínas permanecen en su estado nativo y se separan en el campo eléctrico siguiendo su masa y la masa de sus complejos, respectivamente. Para obtener una separación por tamaño y no por carga neta, como en IEF, se transfiere una carga adicional a las proteínas mediante el uso de azul Brillante de Coomassie o sulfato de dodecilo de litio. Después de completar la primera dimensión, los complejos se destruyen aplicando la página SDS desnaturalizante en la segunda dimensión, donde las proteínas de las que están compuestos los complejos se separan por su masa.
Antes de separar las proteínas en masa, se tratan con dodecil sulfato de sodio (SDS) junto con otros reactivos (SDS-PAGE en 1-D). Esto desnaturaliza las proteínas (es decir, las desdobla en moléculas largas y rectas) y une un número de moléculas SDS aproximadamente proporcionales a la longitud de la proteína. Debido a que la longitud de una proteína (cuando se despliega) es aproximadamente proporcional a su masa, esto equivale a decir que une un número de moléculas de SDS aproximadamente proporcionales a la masa de la proteína. Dado que las moléculas de SDS están cargadas negativamente, el resultado de esto es que todas las proteínas tendrán aproximadamente la misma relación masa-carga que las demás. Además, las proteínas no migrarán cuando no tengan carga (como resultado del paso de enfoque isoeléctrico), por lo tanto, el recubrimiento de la proteína en SDS (carga negativa) permite la migración de las proteínas en la segunda dimensión (SDS-PAGE, no es compatible para su uso en la primera dimensión, ya que está cargada y se necesita usar un detergente no iónico o zwitteriónico).En la segunda dimensión, se vuelve a aplicar un potencial eléctrico, pero en un ángulo de 90 grados desde el primer campo. Las proteínas serán atraídas hacia el lado más positivo del gel (porque el SDS está cargado negativamente) proporcionalmente a su relación masa-carga. Como se explicó anteriormente, esta proporción será casi la misma para todas las proteínas. El progreso de las proteínas se verá frenado por las fuerzas de fricción. Por lo tanto, el gel actúa como un tamiz molecular cuando se aplica la corriente, separando las proteínas en función de su peso molecular con proteínas más grandes que se retienen más arriba en el gel y proteínas más pequeñas que pueden pasar a través del tamiz y alcanzar regiones más bajas del gel.