Exacerbación de la toxicidad del sustrato por IPTG en Escherichia coli BL21(DE3) que lleva una vía metabólica sintética

Biotransformación de TCP por células de E. coli BL21(DE3) en reposo que llevan variantes de una vía de degradación sintética

Variantes de la vía sintética la haloalcano dehalogenasa o el mutante 26 veces más eficiente catalíticamente DhaA31 se introdujeron en E. coli BL21(DE3) . Este huésped fue seleccionado porque ni las enzimas ni los metabolitos de la vía TCP ocurren naturalmente en su red metabólica y debido al amplio repertorio de vectores a dúo disponibles comercialmente para esta cepa, que permiten la coexpresión sintonizable de múltiples genes en una sola célula . Esto resultó en la construcción de un sistema flexible con un riesgo limitado de diálogo cruzado metabólico, en el que la expresión de los tres componentes de la vía podía manipularse ortogonalmente . Tres construida anteriormente E. se probaron los degradadores coli BL21(DE3) designados degWT, deg31 y deg31opt (Tabla 1). El degWT de E. coli lleva una variante de la vía TCP basada en el DhaA de tipo salvaje junto con HheC y EchA, expresada en una relación relativa de 0,24:0,36:0,40, respectivamente, determinada después de la preinducción con IPTG de 0,2 mm (Archivo adicional 1: Fig. S1). Las cepas deg31 y deg31opt llevan la vía TCP con la dehalogenasa DhaA31, pero la relación relativa de las tres enzimas en deg31 es de 0,14:0,41:0,45, mientras que en deg31opt es de 0,63:0,16:0,21. Los experimentos de electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) indicaron que las tres enzimas de la vía juntas representaban una proporción similar de la fracción de proteína soluble total producida por los tres degradadores: 52% para degWT, 54% para deg31 y 44% para deg31opt.

Pre-inducida (0.Se incubaron células de reposo de 2 mm IPTG de cada una de las cepas recombinantes y un control huésped (Tabla 1) en tampón de fosfato con TCP de 2 mm, y se registraron los cursos de tiempo de biotransformación de TCP en un intervalo de 5 h (Fig. 1). Los perfiles de reacción revelaron diferencias fundamentales entre las cepas con respecto a las tasas iniciales de deshalogenación del TCP, la acumulación de intermedios y la eficiencia general de la formación de glicerol. Las concentraciones teóricas de glicerol, de lo contrario utilizadas rápidamente por E. coli, podría calcularse a partir de las concentraciones experimentales de TCP y de intermedios detectados en virtud de la naturaleza ortogonal de la vía . Mientras que deg31opt se benefició del primer paso más rápido (Fig. 1d), la vía mejor equilibrada con mayor producción de glicerol fue deg31 (Fig. 1c). Por otro lado, degWT sufrió una conversión TCP lenta (Fig. 1b), exposición prolongada al sustrato tóxico y salida insuficiente de la vía. Como era de esperar, el control del huésped (que lleva los plásmidos vacíos correspondientes, Fig. 1a) no mostró actividad hacia TCP en el sistema por lotes cerrado.

Las tres E. los recombinantes de coli y la cepa de control que carece de la ruta sintética representan un sistema modelo adecuado para estudiar la contribución de la carga metabólica y la toxicidad del sustrato/metabolito al costo de aptitud de la biotransformación de TCP por catalizadores de células completas.

La evaluación de la carga metabólica y de los efectos de toxicidad del sustrato mediante recubrimiento

La viabilidad celular, estimada mediante recubrimiento, es un parámetro fisiológico clave que debe reflejar la capacidad de las cepas individuales para hacer frente a las tensiones causadas por la carga metabólica y la exposición al TCP . E. coli degradadores de pre-inducida con 0.Los controles IPTG y host de 2 mM se platearon antes y después de 5 h de incubación en tampón de fosfato con o sin TCP de 2 mm. El porcentaje de células sobrevivientes se calculó después de la incubación.

Los datos obtenidos del chapado antes de la incubación (Fig. 2a) ilustran los efectos separados de los elementos individuales de la carga metabólica global impuesta a las células. Varios factores, incluida la presencia de ADN plásmido y los marcadores de selección asociados, la adición de IPTG y la carga debida a la expresión de la vía heteróloga, afectaron la viabilidad de los degradadores en paralelo incluso antes de la adición del sustrato tóxico. El impacto más pronunciado en esta etapa se debió al mantenimiento de plásmidos y a la expresión constitutiva asociada de los genes marcadores de selección de los vectores de Dúo, así como a la presencia de IPTG. La presencia de dos plásmidos de copia media a alta pCDF (20-40 copias por célula) y pETDuet (~40 copias por célula) redujo la viabilidad en un 50 % (P < 0,01; Fig. 2a). La «pre-inducción» del control del huésped con plásmidos vacíos redujo la viabilidad en casi un 40% en relación con el control no inducido (P < 0.01). La expresión de enzimas de la vía en los degradadores de E. coli redujo aún más la viabilidad en aproximadamente un 20 % (P < 0,05). La reducción adicional de la viabilidad de deg31opt en comparación con degWT y deg31 puede atribuirse potencialmente a la diferencia en los marcadores de selección de antibióticos entre tres recombinantes.

Los datos recogidos después de 5 h de incubación con o sin TCP (Fig. 2b y Lima adicional 1: Fig. S2) incluyó varias observaciones inesperadas. Sorprendentemente, el TCP (agregado inicialmente a una concentración de 2 mm) solo tuvo efectos menores o insignificantes en la viabilidad de células de control no inducidas con plásmidos vacíos; no hubo diferencia significativa en la viabilidad entre estas células y los controles del host que no estaban expuestos a TCP ni a IPTG. Esto fue inesperado porque se ha informado que el TCP inhibe fuertemente las células en crecimiento de E. coli BL21 (DE3) y los huéspedes naturales como A. radiobacter AD1 o Pseudomonas putida MC4, incluso a concentraciones 50% más bajas que las utilizadas aquí . Por otro lado, el efecto perjudicial de IPTG fue estadísticamente significativo (P < 0,01) (Fig. 2b y Lima adicional 1: Fig. S2). La observación más llamativa fue que la viabilidad relativa de las células preinducidas con IPTG y luego expuestas al TCP fue casi un 90% menor que la de los controles del huésped expuestos a ninguna de las sustancias (P < 0,01) (Fig. 2b). Esta dramática pérdida de viabilidad no corresponde a una simple suma de los efectos individuales de los dos compuestos; es obvio que el IPTG exacerbó la toxicidad del TCP. El hecho de que el IPTG exacerbara la toxicidad del TCP y no viceversa se confirmó mediante el recubrimiento de tres recombinantes que llevan la ruta de biodegradación sintética (Fig. 2b). Debido a que estos degradadores tenían vías funcionales para la degradación del TCP, eran más capaces de tolerar su presencia. Es importante destacar que cuanto más rápida sea la conversión de TCP por las enzimas de la vía, mayor será la viabilidad de los degradadores. Deg31opt, que logró una rápida conversión inicial de TCP pero acumuló cantidades significativas de los intermedios DCP y GDL, sobrevivió a la incubación de 5 h casi así como al control del huésped que no estuvo expuesto al sustrato. Estos datos son consistentes con los resultados de pruebas de detención de crecimiento reportados anteriormente, que indicaron que el TCP es el compuesto más tóxico en la vía .

La evaluación de la carga metabólica y los efectos de toxicidad del sustrato mediante citometría de flujo multiparamétrica

La citometría de flujo multiparamétrica permite la determinación simultánea de varias variables bioquímicas y físicas inmediatamente después de la preparación de la muestra y, por lo tanto, debe proporcionar información más precisa sobre el estado fisiológico de las células que la que se puede obtener mediante el chapado . Esta técnica también ofrece información clave sobre la heterogeneidad de las poblaciones bacterianas. A diferencia del chapado, no subestima el número de células viables en cultivos originales en los casos en que una fracción de la población ha experimentado lesiones subletales y ha perdido la capacidad de crecer .

La incubación de los tres degradadores y los controles del huésped se llevó a cabo en las condiciones mencionadas en la sección anterior. Las muestras extraídas después de 5 h de incubación con o sin TCP se teñieron con yoduro de propidio (PI), diacetato de 6-carboxi-2′,7′-diclorodifidrofluoresceína (carboxi-H2DCFDA) o bis-(ácido 1,3-dibutilbarbitúrico) trimetina oxonol . Los colorantes para el etiquetado de ácidos nucleicos, como el PI, que solo entra en las células con membranas comprometidas, se usan comúnmente con colorantes sensibles al potencial de membrana, como el DiBAC4(3), que se une a los componentes intracelulares que contienen lípidos, para estudiar la viabilidad bacteriana . Carboxi-H2DCFDA es una forma químicamente reducida, acetilada y carboxilada de fluoresceína que ha encontrado muchas aplicaciones como indicador general de la presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células eucariotas y procariotas . Estudios recientes sobre la utilización bacteriana de hidrocarburos alifáticos clorados sugieren que este proceso está asociado con un fuerte estrés oxidativo y planteamos la hipótesis de que el TCP también provocaría tal respuesta fisiológica . La saturación de ácidos grasos insaturados por halogenación o peroxidación lipídica causa cambios en la fluidez de la membrana, lo que resulta en el colapso de las cadenas de transporte de electrones y la transferencia prematura de electrones al oxígeno, acompañada de formación de ROS, permeabilización de la membrana y muerte celular .

El protocolo de citometría de flujo de punto final adoptado en nuestro estudio fue menos sensible que el chapado para demostrar la carga causada por plásmidos (Fig. 2b), posiblemente porque la presencia de ADN heterólogo y la expresión constitutiva de marcadores de selección no alteraron directamente las propiedades apuntadas por la citometría, sino que desequilibraron el estado energético general de las células. Sin embargo, el método de citometría de flujo utilizando fluorocromos seleccionados fue útil para exponer los efectos tóxicos de IPTG y TCP. No hubo diferencias significativas (P > 0.05) entre los controles de huésped no inducidos con plásmidos vacíos, independientemente de su estado de exposición al TCP, con respecto a cualquiera de las tres variables examinadas en estos experimentos (permeabilidad de membrana, formación de ROS y potencial de membrana; ver Fig. 2b). Sin embargo, la proporción de células con tinción positiva para DiBAC4(3) aumentó hasta tres veces en el control tratado con IPTG solo (P < 0,01). El mismo efecto también se observó en deg31, cuya respuesta a la inducción e incubación con TCP se estudió con más detalle (Fig. 3). La fracción de la población bacteriana que se tiñó positivamente con los tres tintes aumentó muchas veces cuando el pretratamiento con IPTG se combinó con la exposición al TCP, confirmando el efecto exacerbante observado previamente e indicando que la acción del TCP en las células bacterianas se acompaña de una extensa formación de ROS (Figs. 2b y 3). La despolarización de la membrana, la acumulación de ROS y la permeabilidad de la membrana se redujeron en recombinantes de E. coli que expresaban la ruta de biodegradación sintética, siendo el grado de reducción proporcional a las tasas iniciales de conversión de TCP de las cepas. Curiosamente, la exacerbación de la toxicidad compuesta por preinducción del control del huésped BL21(DE3) con IPTG también se confirmó en experimentos con el modelo de compuesto tóxico hidroperóxido de terc-butilo (TBHP), un peróxido orgánico y una fuerte formación de ROS que promueve el agente oxidante (Archivo adicional 1: Fig. S3). Esto sugiere que el fenómeno de exacerbación descrito no debe restringirse solo a nuestro modelo de sustancia química tóxica TCP.

La despolarización de membrana y la formación de ROS in vivo son procesos dinámicos. Para seguir su cinética en degradadores de E. coli también realizamos mediciones con resolución temporal (Archivo adicional 1: Fig. S4). El número de células teñidas por DiBAC4(3) y carboxi-H2DCFDA aumentó linealmente con el tiempo en todos los recombinantes estresados, excepto en deg31. Curiosamente, este degradador exhibió una ráfaga inicial de DiBAC4 (3) y fluorescencia carboxi-H2DCFDA, pero estas señales luego se estancaron o cayeron ligeramente. Suponemos que los perfiles característicos de la fluorescencia DiBAC4(3) y carboxi-H2DCFDA para deg31 están vinculados a su variante única de la ruta de biodegradación sintética y el curso de tiempo correspondiente de la biotransformación del TCP. A diferencia de las otras cepas, el TCP, el 2,3-dicloropropano-1-ol (DCP) y el glicidol (GDL) estuvieron presentes en concentraciones relativamente altas en la mezcla de reacción deg31 entre los minutos 50 y 100 del período de medición. Esto puede haber causado toxicidad sinérgica, aumentando el número de células con membranas despolarizadas y aumentando la formación de ROS. Tales efectos en las articulaciones son comunes; se han observado en plaguicidas organofosforados, fluorosurfactantes y metales pesados, entre otros . La congelación posterior o la caída moderada de la intensidad de las señales se atribuyó a la eliminación paralela de TCP y GDL y a la producción de glicerol, que se sabe que es un protector eficiente del estrés en cepas de E. coli tolerantes a levaduras y disolventes .

La variante de la vía sintética presente en deg31 parecía proporcionar el mejor compromiso en términos de hacer frente a la toxicidad mientras convertía eficientemente el TCP en glicerol inofensivo y, por lo tanto, se seleccionó para una investigación adicional.

La evaluación de la carga metabólica y los efectos de toxicidad del sustrato mediante microscopía electrónica

La carga metabólica y la toxicidad pueden causar cambios en la morfología de los huéspedes bacterianos . Por lo tanto, utilizamos microscopía electrónica de transmisión para estudiar los cambios en la morfología de las células deg31 inducidas y no inducidas después de la incubación de 5 h con o sin TCP de 2 mm (Fig. 3). Imágenes de células de control del huésped de E. coli inducidas y no inducidas con plásmidos vacíos se muestran en (Archivo adicional 1: Fig. S5). Las observaciones microscópicas fueron seguidas por citometría de flujo multiparamétrica de células deg31 teñidas con PI, carboxi-H2DCFDA o DiBAC4(3).

La incubación de degradadores no inducidos con TCP produjo solo una pequeña proporción de células bacterianas muertas, y la morfología de las células tratadas de esta manera generalmente no difiere de la de las células no expuestas al sustrato tóxico (Fig. 3a, b). La proporción de células teñidas por carboxi-H2DCFDA y IP aumentó moderadamente, pero no se observó ningún efecto sobre el potencial de membrana. Las bacterias preinducidas que producen proteínas recombinantes formaron intensamente cuerpos de inclusión visibles y mostraron una separación frecuente de la membrana citoplasmática de la membrana externa en los polos de la célula (Fig. 3c). Dado que la mayoría de las proteínas recombinantes obtenidas de lisados celulares eran solubles (datos no mostrados), creemos que los cuerpos observados consistían en enzimas activas.

La combinación de preinducción e incubación con TCP produjo los cambios morfológicos más pronunciados y se acompañó de aumentos sustanciales en el número de células que se teñían positivamente para PI, carboxi-H2DCFDA y DiBAC4(3) (Fig. 3d). Numerosas células muertas o moribundas con membranas citoplasmáticas dañadas y contenido filtrado eran claramente visibles. Aun así, una parte significativa de la población resistió los efectos combinados de IPTG y TCP durante el período de tratamiento de 5 h. Esto se debió principalmente a la vía sintética bien equilibrada de deg31 y su rápida conversión de TCP a glicerol. La biestabilidad es un fenómeno común y puede atribuirse al ruido en la expresión de los rasgos multigénicos responsables de la tolerancia a la toxicidad y la respuesta gradual al estrés en la población bacteriana . En resumen, nuestras observaciones microscópicas de poblaciones deg31 tratadas en cuatro condiciones diferentes fueron consistentes con los resultados anteriores y respaldaron la conclusión de que la preinducción con IPTG exacerba la toxicidad del TCP.

Aumento del efecto de exacerbación de la toxicidad en células que experimentaron carga metabólica a partir de plásmidos

Dado que tanto los degradadores de E. coli como los controles del huésped utilizados en este trabajo tuvieron que lidiar con la carga metabólica de los plásmidos Duet y el sistema de expresión LACIQ/P lacUV5-T7, decidimos incluir controles de E. coli sin estos componentes en el siguiente experimento. Para ello, utilizamos E. coli BL21 (DE3) sin plásmidos y la cepa de clonación E. coli DH5a, que carece tanto del sistema de expresión LACIQ/P lacUV5-T7 como del operón lac. Al emplear los protocolos de galjanoplastia y citometría de flujo descritos anteriormente, encontramos que el efecto de exacerbación fue modesto o completamente ausente en ambas cepas(Archivo adicional 1: Fig. S6A, B). Esto sugiere que el doble estrés de IPTG y TCP solo se manifiesta en cepas portadoras de plásmidos de Dúo y el sistema de expresión correspondiente.

Suponemos que los recombinantes estudiados no pudieron suprimir de manera eficiente el doble estrés del IPTG y el sustrato tóxico debido a la carga metabólica impuesta por los plásmidos y la correspondiente escasez de recursos necesarios para el mantenimiento celular. Parece que la estructura química del IPTG, su transporte o presencia dentro de la célula desencadena cambios fisiológicos que facilitan la manifestación de toxicidad por TCP en células de E. coli BL21(DE3) con plásmidos de Duet.

Reducir la carga metabólica y la exacerbación de la toxicidad ajustando la concentración de IPTG

A continuación, intentamos reducir la carga impuesta a los recombinantes de E. coli optimizando la concentración de IPTG. Buscamos la menor concentración posible de inductor que minimizara el costo de acondicionamiento físico sin comprometer significativamente la eficiencia del sistema en la degradación del TCP. Se preindujeron células Deg31 con concentraciones de IPTG que oscilaban entre 0,01 y 1,00 mm y se estudiaron los efectos resultantes sobre la viabilidad celular y la eficiencia de la vía (Fig. 4; Lima adicional 1: Fig. S7).

E. se utilizó coli BL21(DE3) con los plásmidos pETDuet y pCDF vacíos como control para el enchapado para evaluar la carga impuesta al huésped por la exposición a IPTG en ausencia de la vía heteróloga (Fig. 4). La viabilidad del degradador y control preinducido se comprobó antes y después de 5 h de incubación en tampón de fosfato con TCP de 2 mm y se comparó con la de células no expuestas a IPTG (Fig. 4a, b). En cada caso se calculó el porcentaje de células supervivientes tras la incubación (Fig. 4c). Estos experimentos indicaron que incluso en ausencia de TCP había una correlación inversa entre la concentración de IPTG y la viabilidad de la E. coli recombinante (Fig. 4a). La cepa deg31 sufrió más por el aumento de las concentraciones de IPTG que el control, probablemente debido a la carga adicional de expresar genes que codifican la vía sintética. Lo contrario ocurrió después de 5 h de incubación, porque la cepa deg31 catabolizante TCP fue más resistente a la toxicidad exacerbada que el control del huésped (Fig. 4b, c). La cepa de la vía sintética mostró tasas de supervivencia similares en todas las concentraciones de IPTG probadas, excepto en la más alta: la viabilidad relativa del deg31 preinducido con IPTG de 1 mM fue del 100%. Asumimos que este valor periférico se debió a la subestimación del número de células viables antes de la incubación debido al intenso estrés experimentado por el degradador en la inducción con una concentración tan alta de IPTG y la presencia resultante de células viables pero no cultivables en la suspensión . Los experimentos de enchapado demostraron que una fracción de la población bacteriana recuperó su capacidad de crecer y reproducirse algún tiempo después del tratamiento con esta alta concentración de IPTG(Archivo adicional 1: Fig. S8).

Los ciclos temporales de biotransformación TCP con células en reposo de deg31 preinducidas con IPTG a 1,00, 0,20, 0,05, 0,025 y 0,01 mm (Archivo adicional 1: Fig. S7) y análisis densitométrico de geles de poliacrilamida SDS con las muestras correspondientes de extractos libres de células (Archivo adicional 1: Fig. S9, cuadro S1) mostró que: i) la relación relativa de las enzimas de la vía y la forma del perfil de degradación no cambiaron sustancialmente con la concentración del inductor, mientras que ii) el contenido de las tres enzimas de la vía en la proteína soluble total de las bacterias recombinantes disminuyó del 55% (1 mM IPTG) al 32% (0,01 mM IPTG) y la producción de la vía disminuyó del 70% al 46%. También se logró una conversión apreciable de TCP con células no inducidas debido a la permeabilidad del promotor T7 y la expresión basal de genes dentro de la vía (Archivo adicional 1: Fig. S7).

La figura 5 resume el equilibrio de los tres parámetros discutidos en las secciones anteriores: (i) viabilidad del huésped, (ii) la expresión celular de las enzimas de la vía, y (iii) la salida de la ruta de biodegradación sintética. Concluimos que la concentración mínima de IPTG que permite la expresión suficiente de genes dentro de la vía para lograr una salida razonable es de 0,025 mm. Se han reportado concentraciones de inductores similares que permiten la expresión génica completa para proteínas recombinantes únicas como la β-galactosidasa, la proteína fluorescente verde y la ramnulosa-1-fosfato aldolasa. Tenga en cuenta que la concentración de IPTG de 0,025 mm es ocho veces menor que la concentración del inductor probado originalmente y hasta 40 veces menor que los valores reportados en la literatura científica que describe la ingeniería de las vías heterólogas en E. coli . La inducción con cantidades más bajas de IPTG mejoró la aptitud del anfitrión. Sin embargo, incluso la concentración más baja de 0,01 mM redujo la viabilidad del degradador de E. coli en un 30% con respecto al deg31 no inducido, y hasta en un 50% con respecto al control del huésped no inducido (P < 0,05 en ambos casos; Fig. 4b). Por lo tanto, investigamos la posibilidad de reemplazar IPTG con un inductor alternativo.

Reducir la carga metabólica y la exacerbación de la toxicidad mediante la inducción con lactosa

La lactosa es un inductor natural del operón lac y se puede emplear como una alternativa más barata al IPTG sintético. Se ha demostrado que induce la expresión de proteínas recombinantes en E. coli en la misma medida que la IPTG en escalas de laboratorio e industriales . A diferencia de la IPTG, la lactosa es un sustrato de la β-galactosidasa (codificada por LacZ) y, por lo tanto, puede ser metabolizada por células con un operón lac intacto, incluyendo E. coli BL21(DE3). Por lo tanto, las concentraciones de lactosa de hasta 30 mm se utilizan comúnmente para inducir la expresión de genes clonados a niveles que se pueden alcanzar con ≤1 mM IPTG .

Investigamos la preinducción de células deg31 con lactosa de 1 mm. Asumimos que esta concentración sería suficiente para inducir la expresión de los genes de la vía de degradación del TCP a niveles que conferirían una eficiencia de degradación adecuada. Esta expectativa fue confirmada por los cursos de tiempo registrados de biotransformación del TCP y el hallazgo de que las enzimas de la vía representaban hasta el 41% de la proteína soluble total de las células en estas condiciones (Archivo adicional 1: Figs. S7 y S9, y cuadro S1). La conversión teórica de TCP en glicerol en estas condiciones fue del 63%. Estos valores son cercanos a los observados para células deg31 preinducidas con IPTG de 0,025 o 0,05 mm. Lo que es más importante, las células deg31 preinducidas con lactosa mostraron una mayor viabilidad antes y después de la incubación de 5 h con TCP en comparación con las bacterias tratadas con IPTG en cualquiera de las concentraciones probadas (P < 0.05; Fig. 4). El mismo efecto de alivio se observó para el control del huésped. En términos de supervivencia, las células preinducidas con lactosa se desempeñaron casi tan bien como sus contrapartes no inducidas (Fig. 4c). De acuerdo con los resultados de la galjanoplastia, el análisis citométrico de flujo de células control del huésped y deg31 preinducidas con lactosa reveló niveles significativamente más bajos de células estresadas con membranas despolarizadas que los observados para cepas de E. coli preinducidas con IPTG (P < 0,01; Archivo adicional 1: Fig. S10). Estos resultados indicaron de nuevo que la acción de IPTG en los recombinantes estudiados fue acompañada consistentemente por cambios en las propiedades de la membrana.

Se informó previamente de una mayor viabilidad de las células inducidas con lactosa en lugar de IPTG para la expresión de proteínas heterólogas individuales . Este efecto se atribuyó a la inducción retardada y más suave lograda con el inductor natural. En contraste con el IPTG sintético, que puede ingresar rápidamente a la célula tanto por difusión pasiva como con la ayuda de la permeasa de lactosa de encaje, la lactosa solo puede ingresar al citoplasma a través de la permeasa. Además, la lactosa debe convertirse en alolactosa por β-galactosidasa antes de unirse al represor lac, mientras que la IPTG se une directamente al represor. Nuestros resultados confirman que la lactosa impone una carga metabólica menor que la IPTG, lo que sugiere que también es un inductor más adecuado para la expresión de vías heterólogas enteras en E. coli BL21(DE3). Esto es particularmente importante para las células de E. coli BL21(DE3) que transportan vías sintéticas que degradan compuestos tóxicos o producen intermedios tóxicos.