Resultados y discusión
El análisis PCR-RFLP reveló patrones de restricción compatibles con el análisis in silico. Todos los perros con malformación de cola presentaban el mismo patrón (3 fragmentos, 2 bandas visibles), que era diferente al presentado por los perros con cola normal (2 fragmentos, 1 banda visible) (Fig.1). Otro ensayo, también basado en PCR-RFLP, se utilizó con éxito para identificar la misma mutación en el gen T de perros, pero utilizando un sistema de electroforesis en gel de poliacrilamida (Gruszczynska & Czapla 2011). El desempeño de la electroforesis en gel de poliacrilamida podría mejorar la resolución de las bandas en relación con los fragmentos de ADN en el presente estudio. Sin embargo, la practicidad se reduciría, ya que este sistema es más laborioso. En el presente estudio, a pesar de que no fue posible visualizar todos los fragmentos de ADN generados después de la digestión, fue posible distinguir fácilmente genotipos mediante electroforesis en gel de agarosa.
Fig.1. PCR-RFLP para la detección de la mutación C189G. Marcador de pares de bases (M), perros afectados – cola corta (1-7) y animal con cola normal (8).
En el análisis de muestras secuenciadas, se observó heterocigosidad C (citosina) G (guanina) en el nucleótido 189 del exón 1 solo en perros con malformación de la cola. La localización de la mutación se basó en la secuencia de ARNm del gen T disponible en el Banco de genes (número de acceso: AJ245513).
En el análisis in silico, también se observó alteración del aminoácido 63 de isoleucina a metionina. Todas las secuencias de ADN obtenidas en el presente estudio se depositaron en Genbank con los números de adhesión: MF495488 (cola corta), MF495489 (ausencia de cola), MF495490 (ausencia de cola) y MF495491 (cola normal).
Aunque solo se encontró un genotipo para la condición actual (GC para animales con malformación de la cola), se observó una variación fenotípica en perros afectados, que es el tamaño de la cola. Algunos animales presentaron cola corta (aproximadamente 3-4 vértebras), y otros mostraron ausencia de cola (aproximadamente 1-2 vértebras) (Fig.2). Fenotipos similares también fueron observados por Haworth et al. (2001) en perros. Aunque todavía no se conoce una explicación para esto en perros, Buckingham et al. (2013), estudiando la variación congénita del tamaño de la cola en gatos, encontraron evidencia de haploinsuficiencia causada por múltiples mutaciones en el gen T. Las mutaciones de C. 1199delC, c. 1169delC y c. 998delT se asociaron con diferentes niveles de expresión génica, lo que podría explicar los diferentes fenotipos entre perros con malformación de cola (Buckingham et al. 2013).
Fig.2. A) Mutación portadora de perro C189G en el gen T. B) Perro de la misma camada sin mutación C189G.
El carácter hereditario de la mutación puede ser evidenciado por el análisis hereditario (Fig.3) de la camada estudiada. Fue posible verificar que la mutación tiene un patrón de herencia autosómico dominante. Sin embargo, no se encontró genotipo homocigoto dominante (GG) en el presente estudio, lo que refuerza las observaciones de que cuando se encuentra en homocigosis, el gen T mutado causa la muerte fetal (Haworth et al. 2001). Hytonen et al. (2009) observaron que las camadas de cruces entre animales de cola normal (genotipo CC) eran un 29% más grandes que las camadas de cruces entre animales de cola malformada (genotipo CG). Este resultado es compatible con la reducción esperada del 25% en la descendencia de cruces con alelos letales.
Fig.3. Heredograma que muestra el patrón hereditario de la mutación C189G en el gen T del Labrador Retriever. Cruce entre abuelos maternos (I), camada del perro afectado y su cruce con macho normal (II) y camada analizada (III).
Las mutaciones en el gen T se han asociado con malformación de la cola en otras especies, como ratones y gatos (Wilson et al. 1995, Buckingham et al. 2013). Y en algunos de ellos también se observan otros cambios, como la incontinencia urinaria y fecal en gatos (Robinson 1993). Sin embargo, en perros, hasta la fecha, solo se ha observado malformación de cola en animales heterocigotos (GC) (Indrebo et al. 2008). Aunque en algunas razas caninas el fenotipo de «malformación de cola» no se asoció con la mutación C189G (Boston Terrier, Bulldog Inglés, King Charles Spaniel, Schnauzer Miniatura, Parson Russell Terrier y Rottweiler), el gran número de razas afectadas sugiere una mutación antigua (Hytonen et al. 2009), estando presente en perros ancestrales antes de la formación de muchas razas. Sin embargo, el cruzamiento interracial también puede haber contribuido a la difusión de la mutación, ya que los animales heterocigotos GC parecen no tener alteraciones de la libido o del rendimiento reproductivo. Otro factor que puede haber contribuido a la difusión de mutaciones fue el uso en la reproducción de perros sin cola, cuando la caudectomía estética todavía estaba permitida. En este período, es probable que muchos animales con agenesia de cola se hayan utilizado como reproductores, ya que la ausencia de cola era deseable en algunas razas, contribuyendo a la difusión de la mutación.
Actualmente, la práctica de la caudectomía (extirpación quirúrgica de la cola) es un procedimiento prohibido en varios países del mundo como los de la Unión Europea y Brasil (Haworth et al. 2001, CFMV 2013). En algunos países de la Unión Europea, se utilizan pruebas genéticas para identificar la mutación C189G en el gen T para verificar si la ausencia de cola en algunas razas es de origen congénito o si los animales se sometieron a un procedimiento quirúrgico irregular. La PCR-RFLP utilizada en el presente estudio fue una técnica simple y precisa para identificar esta mutación y podría utilizarse como evidencia para identificar la práctica ilegal de la caudectomía.
Debido a la escasez de información sobre la mutación C189G en el gen T de perros, no hay más información sobre su asociación con otros caracteres morfológicos o incluso fisiológicos, y por lo tanto debe investigarse.