1 Introducción
Los genes para proteínas transmembranas (TMPs) constituyen el 20-30% de la mayoría de los genomas (Wallin & Heijne, 1998), y en función de sus funciones críticas en la fisiología celular, las TMPs son el blanco de una gran fracción de medicamentos clínicamente útiles. Por lo tanto, la determinación de sus estructuras y modos de acción es de considerable importancia. Sin embargo, el número de estructuras TMP de alta resolución disponibles sigue siendo relativamente bajo (véase la página web de Stephen White; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Dos explicaciones que se invocan con frecuencia para la dificultad de obtener cristales bien difractantes de TMPs para su uso en estudios de difracción de rayos X son (1) las TMPs son estructuralmente dinámicas con regiones flexibles que dificultan que la proteína adopte la conformación uniforme requerida para empaquetarse en un cristal; y (2) las superficies de las regiones transmembranarias de TMPs no participan tan fácilmente como las superficies de las proteínas solubles globulares en las interacciones proteína-proteína que se requieren para empaquetar cristales. La introducción de una proteína soluble estable en una región expuesta a la superficie de un TMP proporciona una forma de evitar potencialmente estos dos problemas, ya que dicha inserción en una ubicación interna en un TMP puede reducir la flexibilidad general y ya que la presencia de un dominio soluble fácilmente cristalizable puede proporcionar contactos intermoleculares necesarios para la cristalización (Chun et al., 2012; Engel, Chen, & Privé, 2002).
La fusión de lisozima T4 (T4L) en ubicaciones internas en TMPs ha proporcionado, hasta la fecha, un enfoque exitoso para la determinación de las estructuras de diversos miembros de la importante superfamilia de GRCP (Cherezov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Fenalti et al., 2014; Granier et al., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola et al., 2008; Kruse et al., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; White et al., 2012; Wu et al., 2010, 2012; Xu et al., 2011; Zhang et al., 2012). Fusiones internas similares de un apocitocromo b estabilizado térmicamente (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014) y rubredoxina (Tan et al., 2013) también han producido estructuras de RQFG. Además, se han obtenido varias estructuras de GPCR por cristalización de construcciones en las que el compañero de proteína estabilizadora se fusionó en el extremo N de la secuencia del receptor, en lugar de en una posición interna (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thompson et al., 2012; Wu et al., 2014), sugiriendo que el papel de las proteínas de fusión en la facilitación de la formación de contactos intermoleculares puede ser más importante para promover la cristalización que la reducción de la flexibilidad de la TMP. Los enfoques alternativos para obtener estructuras de GPCR que no involucran el uso de proteínas de fusión han incluido la cocristalización con anticuerpos anti-receptor (Kruse et al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et al., 2013) y la cristalización de variantes de GPCR que se han termoestabilizado mediante la introducción de mutaciones y eliminaciones puntuales (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). De hecho, la mayoría de las variantes de GPCR que contienen proteínas de fusión utilizadas para la determinación exitosa de la estructura también han incorporado mutaciones puntuales y truncamientos diseñados para mejorar aún más la estabilidad de las proteínas y reducir la flexibilidad.
La inserción de proteínas solubles estables en TMPs con el fin de promover la cristalización generalmente se ha realizado como una inserción o reemplazo de residuos en el tercer bucle intracelular (IC3) de GPCR. Esto se basa en la expectativa de que esta región en los receptores es flexible y puede controlar el movimiento relativo de las hélices circundantes (Rosenbaum et al., 2007), así como reducir la probabilidad de que la inserción del socio de fusión interrumpa la estructura general de la GRCP (Chun et al., 2012). Si bien tales inserciones a menudo no interrumpen las estructuras generales de los receptores (basadas en la retención de al menos alguna afinidad de unión a ligandos por los constructos de fusión), generalmente resultan en la pérdida de la capacidad de activar la proteína G trimérica cognada (Rosenbaum et al., 2007), lo que no es sorprendente, ya que el bucle IC3 es a menudo el sitio de interacciones funcionales entre los GPCR y las proteínas G triméricas que son sus efectores posteriores inmediatos. Además, no están bien establecidos los criterios para establecer puntos de unión particulares para la inserción de proteínas de fusión y para determinar la cantidad de secuencia de receptores que reemplazan. Una fusión exitosa debe proporcionar una coincidencia óptima entre el espaciado y la orientación de los terminales N y C de la proteína insertada y los sitios de unión en la GRCP (Chun et al., 2012; Engel et al., 2002). Por lo tanto, la creación de una fusión útil puede requerir la síntesis o construcción de múltiples versiones de genes fusionados (Rosenbaum et al., 2007).
Describimos aquí una estrategia para generar y seleccionar una biblioteca de formas variantes de un receptor que contiene inserciones de T4L en diferentes puntos del tercer bucle intracelular (IC3) como reemplazo de diferentes números de residuos de aminoácidos en la secuencia de bucle (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Mediante la expresión de receptores en levadura, es posible crear bibliotecas aleatorias de variantes con inserciones de lisozimas y detectar directamente construcciones con niveles máximos de expresión general, números de sitios de unión de ligandos en la superficie celular e incluso la función del receptor, analizada en función de la activación de la proteína G cognada. Los enfoques tuvieron éxito en la identificación de receptores con inserciones en el bucle IC3 que retienen la función de señalización casi completa. Esto sugiere que, cuando se une a través de secuencias de enlace apropiadas, la molécula T4L se puede insertar en este bucle sin impedir el acceso de la proteína G a las superficies relevantes del receptor activado.
Los protocolos descritos se desarrollaron utilizando Ste2p, una GPCR endógena de la levadura Saccharomyces cerevisiae utilizada como sistema inicial manejable para el que aún no se dispone de estructura tridimensional. Sin embargo, se podrían utilizar enfoques similares para identificar variantes que contienen inserción de los numerosos GPCR de mamíferos que se ha informado que son capaces de activar la vía de respuesta de feromonas de levadura (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), o a otras TMPs para las que es posible evaluar la función en células intactas. Además, las especies de levadura se han utilizado como sistemas de expresión para la determinación de la estructura de GPCR y otras TMPs (Clark et al., 2010), incluso para la determinación de la estructura cristalina del receptor de histamina H1 humano (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p es el receptor del factor α de feromona de apareamiento de levadura, un péptido de 13 residuos. La unión de este ligando resulta en la activación de una proteína G heterotrimérica citoplasmática, que, a su vez, activa una vía de quinasa MAP, lo que en última instancia conduce a respuestas transcripcionales, cambios en la forma celular, detención del ciclo celular y fusión con células de levadura del tipo de apareamiento opuesto.