Clásicamente, para realizar un radioinmunoanálisis, una cantidad conocida de un antígeno se convierte en radiactivo, frecuentemente etiquetándolo con isótopos gamma radioactivos de yodo, como 125-I, unidos a la tirosina. Este antígeno radiomarcado se mezcla con una cantidad conocida de anticuerpo para ese antígeno, y como resultado, los dos se unen específicamente entre sí. Luego, se agrega una muestra de suero de un paciente que contiene una cantidad desconocida de ese mismo antígeno. Esto hace que el antígeno sin etiquetar (o «frío») del suero compita con el antígeno radiomarcado («caliente») para los sitios de unión de anticuerpos. A medida que aumenta la concentración de antígeno «frío», una mayor parte se une al anticuerpo, desplazando la variante radiomarcada y reduciendo la proporción de antígeno radiomarcado unido a anticuerpos y antígeno radiomarcado libre. A continuación, se separan los antígenos unidos y se mide la radiactividad del antígeno libre(no unido) que queda en el sobrenadante mediante un contador gamma.
Este método se puede utilizar para cualquier molécula biológica en principio y no se limita a los antígenos séricos, ni se requiere utilizar el método indirecto de medición del antígeno libre en lugar de medir directamente el antígeno capturado. Por ejemplo, si no es deseable o no es posible radiomarcar el antígeno o la molécula objetivo de interés, se puede realizar un AIR si hay disponibles dos anticuerpos diferentes que reconocen el objetivo y el objetivo es lo suficientemente grande (por ejemplo, una proteína) para presentar múltiples epítopos a los anticuerpos. Un anticuerpo sería radiomarcado como el anterior, mientras que el otro permanecería sin modificar. La RIA comenzaría con el anticuerpo» frío » sin etiquetar que se permite interactuar y unirse a la molécula objetivo en solución. Preferiblemente, este anticuerpo sin etiquetar está inmovilizado de alguna manera, como acoplado a un cordón de agarosa, recubierto a una superficie,etc. A continuación, se permite que el anticuerpo radiomarcado «caliente» interactúe con el primer complejo de molécula diana de anticuerpos. Después de un lavado exhaustivo, se mide la cantidad directa de anticuerpos radioactivos unidos y se cuantifica la cantidad de molécula diana comparándola con una cantidad de referencia analizada al mismo tiempo. Este método es similar en principio al método ELISA sándwich no radiactivo.