In this blog post, the differences between molecular absorption, excitation and emission spectra are explained.
Absorption Spectra
Figure 1: Absorption spectrum of anthracene in cyclohexane measured using the FS5 Spectrofluorometer. Experimental parameters: Δλ = 1 nm.
Los espectros de absorción (también conocidos como espectros UV-Vis, espectros de absorbancia y espectros electrónicos) muestran el cambio en la absorbancia de una muestra en función de la longitud de onda de la luz incidente (Figura 1), y se miden utilizando un espectrofotómetro. Los espectros de absorción se miden variando la longitud de onda de la luz incidente utilizando un monocromador y registrando la intensidad de la luz transmitida en un detector. La intensidad de la luz transmitida a través de la muestra, ISample, (como un analito disuelto en disolvente) y la intensidad de la luz a través de un blanco, IBlank, (solo disolvente) se registran y la absorbancia de la muestra se calcula utilizando:
La absorbancia es linealmente proporcional a la concentración molar de la muestra; lo que permite calcular la concentración de la muestra a partir del espectro de absorción utilizando la Ley de Beer-Lambert.
Figura 2: Esquema de la medición de los espectros de absorción en un espectrofotómetro.
Espectros de excitación
Figura 3: Espectro de excitación de fluorescencia de antraceno en ciclohexano medido utilizando el espectrofluorómetro FS5. Parámetros experimentales: λem = 420 nm, Δλem = 1 nm, Δλex = 1 nm.
Los espectros de excitación de fluorescencia muestran el cambio en la intensidad de fluorescencia en función de la longitud de onda de la luz de excitación (Figura 3), y se miden utilizando un espectrofluorómetro. La longitud de onda del monocromador de emisión se ajusta a una longitud de onda de emisión de fluorescencia conocida por la muestra, y la longitud de onda del monocromador de excitación se escanea en el rango de excitación deseado y la intensidad de fluorescencia se registra en el detector en función de la longitud de onda de excitación. Si la muestra obedece la Regla de Kasha y la Regla de Vavilov, entonces el espectro de excitación y el espectro de absorción serán idénticos (compare las Figuras 1 y 3). Por lo tanto, los espectros de excitación pueden considerarse espectros de absorción detectados por fluorescencia.
Figure 4: Schematic of the measurement of excitation spectra in a spectrofluorometer.
Emission Spectra
Figure 5: Fluorescence emission spectrum of anthracene in cyclohexane measured using the FS5 Spectrofluorometer. Experimental parameters: λex = 340 nm, Δλex = 1 nm, Δλem= 1 nm
Los espectros de emisión de fluorescencia muestran el cambio en la intensidad de fluorescencia en función de la longitud de onda de la luz de emisión (Figura 5), y se miden utilizando un espectrofluorómetro. La longitud de onda del monocromador de excitación se ajusta a una longitud de onda de absorción conocida por la muestra, y la longitud de onda del monocromador de emisión se escanea en el rango de emisión deseado y la intensidad de la fluorescencia se registra en el detector en función de la longitud de onda de emisión.
Figura 6: Esquema de la medición de los espectros de emisión en un espectrofluorómetro.
Más información
Para obtener más información sobre la teoría de la espectroscopia de absorción y fluorescencia, consulte la sección de preguntas frecuentes en nuestro blog.
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