Esacerbazione di substrato tossicità da IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) la realizzazione di un sintetico percorso metabolico

Biotrasformazione di TCP con il riposo E. coli BL21(DE3) le cellule che trasportano le varianti di un sintetico via di degradazione

Varianti del sintetico percorso con il wild-type settore dell’haloalkane o il 26 volte cataliticamente più efficiente mutante DhaA31 sono stati introdotti in E. coli BL21(DE3) . Questo ospite è stato selezionato perché né gli enzimi né i metaboliti della via TCP si trovano naturalmente nella sua rete metabolica e per l’ampio repertorio di vettori Duet disponibili in commercio per questo ceppo, che consentono la co-espressione sintonizzabile di più geni in una singola cellula . Ciò ha portato alla costruzione di un sistema flessibile con un rischio limitato di cross-talk metabolico, in cui l’espressione dei tre componenti della via potrebbe essere manipolata ortogonalmente . Tre precedentemente costruito E. sono stati testati i degradatori coli BL21(DE3) designati degWT, deg31 e deg31opt (Tabella 1). E. coli degWT porta una variante del percorso TCP basata sul DhaA wild-type insieme a HheC e EchA, espressa in un rapporto relativo di 0.24:0.36:0.40, rispettivamente, come determinato dopo pre-induzione con IPTG 0.2 mM (File aggiuntivo 1: Fig. S1). I ceppi deg31 e deg31opt portano entrambi il percorso TCP con la dealogenasi ingegnerizzata DhaA31, ma il rapporto relativo dei tre enzimi in deg31 è 0.14:0.41:0.45 mentre in deg31opt è 0.63:0.16:0.21. Gli esperimenti di elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) hanno indicato che i tre enzimi della via insieme rappresentavano una proporzione simile della frazione proteica solubile totale prodotta da tutti e tre i degradatori: 52% per degWT, 54% per deg31 e 44% per deg31opt.

Pre-indotta (0.2 mm IPTG) le cellule a riposo di ciascuno dei ceppi ricombinanti e un controllo ospite (Tabella 1) sono state incubate in tampone fosfato con TCP 2 mM e sono stati registrati i cicli temporali della biotrasformazione TCP su un intervallo di 5 h (Fig. 1). I profili di reazione hanno rivelato differenze fondamentali tra i ceppi rispetto ai tassi iniziali di dealogenazione TCP, all’accumulo di intermedi e all’efficienza complessiva della formazione di glicerolo. Le concentrazioni teoriche di glicerolo, altrimenti rapidamente utilizzato da E. coli, potrebbe essere calcolato dalle concentrazioni sperimentali di TCP e intermedi rilevati in virtù della natura ortogonale della via . Mentre deg31opt ha beneficiato del primo passo più veloce (Fig. 1d), la via più equilibrata con la più alta produzione di glicerolo era deg31 (Fig. 1c). D’altra parte, degWT ha sofferto di una lenta conversione TCP (Fig. 1b), esposizione prolungata al substrato tossico ed uscita insufficiente di via. Come previsto, il controllo host (portando i corrispondenti plasmidi vuoti, Fig. 1a) non ha mostrato alcuna attività verso TCP nel sistema batch chiuso.

Le tre E. i ricombinanti coli e il ceppo di controllo privo della via sintetica rappresentano un sistema modello adatto per studiare il contributo del carico metabolico e della tossicità substrato/metabolita al costo di idoneità della biotrasformazione TCP da parte di catalizzatori a cellule intere.

Valutazione del carico metabolico e degli effetti di tossicità del substrato mediante placcatura

La vitalità cellulare, stimata mediante placcatura, è un parametro fisiologico chiave che dovrebbe riflettere la capacità dei singoli ceppi di far fronte agli stress causati dal carico metabolico e dall’esposizione al TCP . E. coli degradanti pre-indotti con 0.I controlli IPTG e host da 2 mm sono stati placcati prima e dopo 5 ore di incubazione in tampone fosfato con o senza TCP da 2 mm. La percentuale di cellule sopravvissute è stata calcolata dopo l’incubazione.

I dati ottenuti dalla placcatura prima dell’incubazione (Fig. 2a) illustrare gli effetti separati dei singoli elementi del carico metabolico complessivo imposto alle cellule. Diversi fattori, tra cui la presenza di DNA plasmidico e i marcatori di selezione associati, l’aggiunta di IPTG e il carico dovuto all’espressione della via eterologa hanno influenzato la vitalità dei degradatori in parallelo anche prima dell’aggiunta del substrato tossico. L’impatto più pronunciato in questa fase era dovuto al mantenimento del plasmide e all’espressione costitutiva associata dei geni marcatori di selezione dai vettori Duet, nonché alla presenza di IPTG. La presenza di due plasmidi a copia medio-alta pCDF (20-40 copie per cella) e pETDuet (~40 copie per cella) ha ridotto la vitalità del 50% (P < 0,01; Fig. 2 bis). La “preinduzione” del controllo ospite con plasmidi vuoti ha ridotto la vitalità di quasi il 40% rispetto al controllo non indotto (P < 0,01). L’espressione degli enzimi pathway nell’E. coli degrada ulteriormente la vitalità ridotta di circa il 20% (P < 0,05). Un’ulteriore riduzione della vitalità di deg31opt rispetto a degWT e deg31 può essere potenzialmente attribuita alla differenza nei marcatori di selezione degli antibiotici tra tre ricombinanti.

I dati raccolti dopo 5 ore di incubazione con o senza TCP (Fig. 2b e file aggiuntivo 1: Fig. S2) includeva diverse osservazioni inaspettate. Sorprendentemente, TCP (inizialmente aggiunto a una concentrazione di 2 mm) ha avuto solo effetti minori o trascurabili sulla vitalità delle cellule di controllo non indotte che portano plasmidi vuoti; non c’era alcuna differenza significativa nella vitalità tra queste celle e i controlli host che non erano esposti né a TCP né IPTG. Questo è stato inaspettato perché TCP è stato segnalato per inibire fortemente le cellule in crescita di E. coli BL21 (DE3) e ospiti naturali come A. radiobacter AD1 o Pseudomonas putida MC4 anche a concentrazioni inferiori del 50% rispetto a quelle utilizzate qui . D’altra parte, l’effetto dannoso di IPTG era statisticamente significativo (P < 0.01) (Fig. 2b e file aggiuntivo 1: Fig. S2). L’osservazione più sorprendente è stata che la vitalità relativa delle cellule pre-indotte con IPTG e quindi esposte a TCP era quasi del 90% inferiore a quella dei controlli host esposti a nessuna delle due sostanze (P < 0.01) (Fig. 2 ter). Questa drammatica perdita di vitalità non corrisponde ad una semplice somma degli effetti individuali dei due composti; è ovvio che l’IPTG ha esacerbato la tossicità del TCP. Il fatto che l’IPTG abbia esacerbato la tossicità del TCP e non viceversa è stato confermato dalla placcatura di tre ricombinanti con la via di biodegradazione sintetica (Fig. 2 ter). Poiché questi degradatori avevano percorsi funzionali per la degradazione TCP, erano meglio in grado di tollerare la sua presenza. È importante sottolineare che più veloce è la conversione del TCP da parte degli enzimi pathway, maggiore è la vitalità dei degradatori. Deg31opt, che ha ottenuto una rapida conversione iniziale di TCP ma ha accumulato quantità significative degli intermedi DCP e GDL, è sopravvissuto all’incubazione di 5 h quasi come il controllo host che non è stato esposto al substrato. Questi dati sono coerenti con i risultati precedentemente riportati dei test di arresto della crescita, che indicavano che il TCP è il composto più tossico nella via .

Valutazione del carico metabolico e degli effetti della tossicità del substrato mediante citometria a flusso multi-parametro

La citometria a flusso multi-parametro consente la determinazione simultanea di diverse variabili biochimiche e fisiche immediatamente dopo la preparazione del campione e quindi dovrebbe fornire informazioni più accurate sullo stato fisiologico delle cellule rispetto a quelle ottenibili mediante placcatura . Questa tecnica offre anche informazioni chiave sull’eterogeneità delle popolazioni batteriche. A differenza della placcatura, non sottovaluta il numero di cellule vitali nelle colture originali nei casi in cui una frazione della popolazione ha subito lesioni subletali e ha perso la capacità di crescere .

L’incubazione dei tre degradatori e dei controlli dell’ospite è stata condotta nelle condizioni menzionate nella sezione precedente. I campioni prelevati dopo 5 ore di incubazione con o senza TCP sono stati colorati con propidio ioduro (PI), 6-carbossi-2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato (carbossi-H2DCFDA) o bis-(acido 1,3-dibutilbarbiturico) trimetina ossonolo . I coloranti per l’etichettatura degli acidi nucleici, come il PI, che entra solo nelle cellule con membrane compromesse, sono comunemente usati con coloranti potenzialmente sensibili alla membrana come DiBAC4 (3), che lega i componenti intracellulari contenenti lipidi, per studiare la vitalità batterica . Carbossi-H2DCFDA è una forma chimicamente ridotta, acetilata e carbossilata di fluoresceina che ha trovato molte applicazioni come indicatore generale per la presenza di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nelle cellule eucariotiche e procariotiche . Recenti studi sull’utilizzo batterico di idrocarburi alifatici clorurati suggeriscono che questo processo è associato a forte stress ossidativo e abbiamo ipotizzato che il TCP evocherebbe anche una tale risposta fisiologica . La saturazione degli acidi grassi insaturi per alogenazione o perossidazione lipidica causa cambiamenti nella fluidità della membrana, con conseguente collasso delle catene di trasporto degli elettroni e trasferimento prematuro degli elettroni in ossigeno, accompagnato da formazione di ROS, permeabilizzazione della membrana e morte cellulare .

Il protocollo di citometria a flusso end-point adottato nel nostro studio era meno sensibile della placcatura nel dimostrare il carico causato dai plasmidi (Fig. 2b), forse perché la presenza di DNA eterologo e l’espressione costitutiva dei marcatori di selezione non alteravano direttamente le proprietà bersagliate dalla citometria, ma sbilanciavano invece lo stato energetico complessivo delle cellule. Tuttavia, l’approccio alla citometria a flusso che utilizza fluorocromi selezionati è stato utile per esporre gli effetti tossici di IPTG e TCP. Non ci sono state differenze significative (P > 0.05) tra i controlli host non indotti con plasmidi vuoti, indipendentemente dal loro stato di esposizione TCP, rispetto a una qualsiasi delle tre variabili esaminate in questi esperimenti (permeabilità della membrana, formazione di ROS e potenziale di membrana; vedere Fig. 2 ter). Tuttavia, la percentuale di cellule che si colorano di positivo per DiBAC4 (3) è aumentata fino a triplicare nel controllo trattato con IPTG da solo (P < 0,01). Lo stesso effetto è stato osservato anche in deg31, la cui risposta all’induzione e all’incubazione con TCP è stata studiata in modo più dettagliato (Fig. 3). La frazione della popolazione batterica colorazione positivamente con tutti e tre i coloranti è aumentata di molte volte quando il pre-trattamento con IPTG è stato combinato con l’esposizione TCP, confermando l’effetto esacerbante precedentemente osservato e indicando che l’azione del TCP nelle cellule batteriche è accompagnata da un’ampia formazione di ROS (Fig. 2 ter, 3). La depolarizzazione della membrana, l’accumulo di ROS e la permeabilità della membrana sono state ridotte nei ricombinanti di E. coli che esprimono la via di biodegradazione sintetica, con il grado di riduzione proporzionale ai tassi iniziali di conversione TCP dei ceppi. È interessante notare che l’esacerbazione della tossicità del composto mediante pre-induzione del controllo ospite BL21(DE3) con IPTG è stata confermata anche in esperimenti utilizzando il modello toxic compound tert-butyl hydroperoxide (TBHP), un perossido organico e una forte formazione di ROS che promuove l’agente ossidativo (File aggiuntivo 1: Fig. S3). Ciò suggerisce che il fenomeno di esacerbazione descritto non dovrebbe essere limitato solo al nostro modello TCP chimico tossico.

La depolarizzazione della membrana e la formazione di ROS in vivo sono processi dinamici. Per seguire la loro cinetica nei degradatori di E. coli abbiamo anche eseguito misurazioni risolte nel tempo (File aggiuntivo 1: Fig. S4). Il numero di cellule colorate da DiBAC4 (3) e carbossi-H2DCFDA è aumentato linearmente nel tempo in tutti i ricombinanti stressati ad eccezione di deg31. È interessante notare che questo degradatore ha mostrato uno scoppio iniziale di DiBAC4 (3) e fluorescenza carbossi-H2DCFDA, ma questi segnali si sono poi plateaued o sono diminuiti leggermente. Assumiamo che i profili caratteristici della fluorescenza DiBAC4 (3) e carbossi-H2DCFDA per deg31 siano legati alla sua variante unica della via di biodegradazione sintetica e al corrispondente corso temporale della biotrasformazione TCP. A differenza degli altri ceppi, TCP, 2,3-dicloropropano-1-ol (DCP) e glicidolo (GDL) erano presenti a concentrazioni relativamente elevate nella miscela di reazione deg31 tra i minuti 50 e 100 del periodo di misurazione. Ciò potrebbe aver causato tossicità sinergica, aumentando il numero di cellule con membrane depolarizzate e una maggiore formazione di ROS. Tali effetti congiunti sono comuni; sono stati osservati per pesticidi organofosfati, fluorosurfactants e metalli pesanti, tra gli altri . Il congelamento successivo o la moderata diminuzione dell’intensità dei segnali sono stati attribuiti alla rimozione parallela di TCP e GDL e alla produzione di glicerolo, che è noto per essere un efficace agente protettivo dello stress nei ceppi di lievito e solventi tolleranti di E. coli .

La variante della via sintetica presente in deg31 sembrava fornire il miglior compromesso in termini di affrontare la tossicità convertendo efficacemente il TCP in glicerolo innocuo ed è stata quindi selezionata per ulteriori indagini.

Valutazione del carico metabolico e degli effetti di tossicità del substrato mediante microscopia elettronica

Il carico metabolico e la tossicità possono causare cambiamenti nella morfologia degli ospiti batterici . Abbiamo quindi utilizzato la microscopia elettronica a trasmissione per studiare i cambiamenti nella morfologia delle cellule deg31 indotte e non indotte dopo incubazione di 5 ore con o senza TCP da 2 mm (Fig. 3). Immagini di cellule di controllo dell’ospite di E. coli indotte e non indotte con plasmidi vuoti sono mostrate in (File aggiuntivo 1: Fig. S5). Osservazioni microscopiche sono state seguite da citometria a flusso multi-parametro di cellule deg31 colorate con PI, carbossi-H2DCFDA o DiBAC4(3).

L’incubazione di degradatori non indotti con TCP ha prodotto solo una piccola percentuale di cellule batteriche morte e la morfologia delle cellule trattate in questo modo non differiva generalmente da quella delle cellule non esposte al substrato tossico (Fig. 3 bis, lettera b). La percentuale di cellule macchiate da carbossi-H2DCFDA e PI è aumentata moderatamente, ma non è stato osservato alcun effetto sul potenziale di membrana. I batteri pre-indotti che producono proteine ricombinanti formavano intensamente corpi di inclusione visibili e mostravano una frequente separazione della membrana citoplasmatica dalla membrana esterna ai poli della cellula(Fig. 3 quater). Poiché la maggior parte delle proteine ricombinanti ottenute dai lisati cellulari erano solubili (dati non mostrati), riteniamo che i corpi osservati consistessero in enzimi attivi.

La combinazione di preinduzione e incubazione con TCP ha prodotto i cambiamenti morfologici più pronunciati ed è stata accompagnata da sostanziali aumenti del numero di cellule che colorano positivamente per PI, carbossi-H2DCFDA e DiBAC4(3) (Fig. 3d). Numerose cellule morte o morenti con membrane citoplasmatiche danneggiate e contenuti fuoriusciti erano chiaramente visibili. Anche così, una parte significativa della popolazione ha resistito agli effetti combinati di IPTG e TCP durante il periodo di trattamento di 5 h. Ciò era dovuto principalmente al percorso sintetico ben bilanciato di deg31 e alla sua rapida conversione di TCP in glicerolo. La bistabilità è un fenomeno comune e può essere attribuita al rumore nell’espressione dei tratti multigenici responsabili della tolleranza alla tossicità e della risposta allo stress graduata nella popolazione batterica . In sintesi, le nostre osservazioni microscopiche di popolazioni deg31 trattate in quattro diverse condizioni sono state coerenti con i risultati precedenti e hanno supportato la conclusione che la pre-induzione con IPTG aggrava la tossicità TCP.

Tossicità esacerbazione effetto sorge in cellule vivendo metabolico peso da plasmidi

, Dato che sia l’E. coli degraders e i controlli host utilizzato in questo lavoro avevano a che fare con la metabolica peso del Duetto plasmidi e LacIQ/P lacUV5 -T7 sistema di espressione, abbiamo deciso di includere E. coli controlli senza questi componenti nel seguente esperimento. A questo scopo, abbiamo utilizzato E. coli BL21 (DE3) senza plasmidi e il ceppo di clonazione E. coli DH5a, che manca sia del sistema di espressione LacIQ/P lacUV5-T7 che dell’operone lac. Utilizzando i protocolli di placcatura e citometria a flusso sopra descritti, abbiamo scoperto che l’effetto di esacerbazione era modesto o completamente assente in entrambi i ceppi (File aggiuntivo 1: Fig. S6 BIS, B). Ciò suggerisce che il doppio stress da IPTG e TCP si manifesta solo in ceppi che trasportano plasmidi Duet e il sistema di espressione corrispondente.

Presumiamo che i ricombinanti studiati non possano sopprimere efficacemente il doppio stress da IPTG e dal substrato tossico a causa del carico metabolico imposto dai plasmidi e della corrispondente carenza di risorse necessarie per il mantenimento delle cellule. Sembra che la struttura chimica di IPTG, il suo trasporto o presenza all’interno della cellula inneschi cambiamenti fisiologici che facilitano la manifestazione della tossicità TCP nelle cellule di E. coli BL21(DE3) con plasmidi Duet.

Ridurre il carico metabolico e l’esacerbazione della tossicità sintonizzando la concentrazione di IPTG

Successivamente, abbiamo tentato di ridurre l’onere imposto ai ricombinanti di E. coli ottimizzando la concentrazione di IPTG. Abbiamo cercato la più bassa concentrazione possibile di induttore che minimizzasse il costo di fitness senza compromettere significativamente l’efficienza del sistema a degradare TCP. Le cellule Deg31 sono state pre-indotte con concentrazioni IPTG comprese tra 0,01 e 1,00 mm e sono stati studiati gli effetti risultanti sulla vitalità cellulare e sull’efficienza della via (Fig. 4; File aggiuntivo 1: Fig. S7).

E. coli BL21 (DE3) con i plasmidi PETDUET e pCDF vuoti è stato utilizzato come controllo per la placcatura per valutare il carico imposto all’ospite dall’esposizione IPTG in assenza della via eterologa (Fig. 4). La vitalità del degradatore e del controllo pre-indotti è stata controllata prima e dopo 5 ore di incubazione in tampone fosfato con TCP 2 mM e confrontata con quella delle cellule non esposte a IPTG (Fig. 4 bis, lettera b). La percentuale di cellule sopravvissute dopo l’incubazione è stata calcolata in ciascun caso (Fig. 4 quater). Questi esperimenti hanno indicato che anche in assenza di TCP c’era una correlazione inversa tra la concentrazione IPTG e la vitalità dell’E. coli ricombinante (Fig. 4 bis). Il ceppo deg31 ha sofferto più dell’aumento delle concentrazioni di IPTG rispetto al controllo, probabilmente a causa dell’onere aggiuntivo di esprimere i geni che codificano la via sintetica. Il contrario era vero dopo 5 h di incubazione perché il ceppo deg31 TCP-catabolizzante era più resistente alla tossicità esacerbata rispetto al controllo ospite (Fig. 4 ter, lettera c). Il ceppo pathway sintetico ha mostrato tassi di sopravvivenza simili a tutte le concentrazioni IPTG testate tranne che per il più alto – la vitalità relativa di deg31 pre-indotta con IPTG da 1 mm è stata del 100%. Abbiamo ipotizzato che questo valore periferico fosse dovuto alla sottostima del numero di cellule vitali prima dell’incubazione a causa dello stress intenso sperimentato dal degradatore all’induzione con una concentrazione così elevata di IPTG e la conseguente presenza di cellule vitali ma non culturabili nella sospensione . Esperimenti di placcatura hanno dimostrato che una frazione della popolazione batterica ha riacquistato la sua capacità di crescere e riprodursi qualche tempo dopo il trattamento con questa alta concentrazione di IPTG (File aggiuntivo 1: Fig. S8).

I cicli temporali della biotrasformazione TCP con celle a riposo di deg31 preindotte con IPTG a 1,00, 0,20, 0,05, 0,025 e 0,01 mM (File aggiuntivo 1: Fig. S7) e analisi densitometrica di gel di poliacrilammide SDS con i corrispondenti campioni di estratti senza cellule (File aggiuntivo 1: Fig. S9, Tabella S1) ha mostrato che: (i) il rapporto relativo tra gli enzimi della via e la forma del profilo di degradazione non è cambiato sostanzialmente con la concentrazione dell’induttore, mentre (ii) il contenuto dei tre enzimi della via nella proteina solubile totale dei batteri ricombinanti è diminuito dal 55 % (1 mm IPTG) al 32 % (0,01 mM IPTG) e l’output della via è diminuito dal 70 al 46 %. La conversione apprezzabile di TCP è stata raggiunta anche con cellule non indotte a causa della perdita del promotore T7 e dell’espressione basale dei geni all’interno della via (File aggiuntivo 1: Fig. S7).

La figura 5 riassume l’equilibrio dei tre parametri discussi nelle sezioni precedenti: (i) la vitalità dell’ospite, (ii) l’espressione cellulare degli enzimi pathway e (iii) l’output della via di biodegradazione sintetica. Concludiamo che la concentrazione minima di IPTG che permette l’espressione sufficiente dei geni all’interno della via per raggiungere un’uscita ragionevole è 0.025 mm. Le concentrazioni simili dell’induttore che permettono l’espressione genica completa sono state riferite per le singole proteine ricombinanti quali β-galattosidasi, la proteina fluorescente verde e l’aldolasi del rhamnulose-1-fosfato . Si noti che la concentrazione IPTG di 0,025 mm è otto volte inferiore alla concentrazione dell’induttore originariamente testata e fino a 40 volte inferiore ai valori riportati nella letteratura scientifica che descrive l’ingegneria delle vie eterologhe in E. coli . L’induzione con quantità inferiori di IPTG ha migliorato la forma fisica dell’host. Tuttavia, anche la concentrazione più bassa di 0,01 mm ha ridotto la vitalità del degradatore di E. coli del 30% rispetto al deg31 non indotto e fino al 50% rispetto al controllo ospite non indotto (P < 0,05 in entrambi i casi; Fig. 4 ter). Abbiamo quindi studiato la possibilità di sostituire IPTG con un induttore alternativo.

Ridurre il carico metabolico e l’esacerbazione della tossicità inducendo con lattosio

Il lattosio è un induttore naturale dell’operone lac e può essere impiegato come alternativa più economica all’IPTG sintetico. È stato dimostrato che induce l’espressione di proteine ricombinanti in E. coli nella stessa misura di IPTG su scale sia di laboratorio che industriali . In contrasto con IPTG, il lattosio è un substrato di β-galattosidasi (codificato da lacZ) e quindi può essere metabolizzato dalle cellule con un operone lac intatto, incluso E. coli BL21(DE3). Pertanto, concentrazioni di lattosio fino a 30 mm sono comunemente utilizzate per indurre l’espressione di geni clonati a livelli che possono essere raggiunti con IPTG ≤1 mM .

Abbiamo studiato la pre-induzione delle cellule deg31 con lattosio da 1 mm. Abbiamo ipotizzato che questa concentrazione sarebbe stata sufficiente per indurre l’espressione dei geni della via di degradazione TCP a livelli che conferirebbero un’adeguata efficienza di degradazione. Questa aspettativa è stata confermata dai cicli temporali registrati di biotrasformazione TCP e dalla scoperta che gli enzimi pathway rappresentavano fino al 41% della proteina solubile totale delle cellule in queste condizioni (File aggiuntivo 1: Figs. S7 e S9 e Tabella S1). La conversione teorica di TCP in glicerolo in queste condizioni era del 63%. Questi valori sono vicini a quelli osservati per le cellule deg31 pre-indotte con IPTG 0.025 o 0.05 mM. Soprattutto, le cellule deg31 pre-indotte con lattosio hanno mostrato una maggiore vitalità prima e dopo l’incubazione di 5 ore con TCP rispetto ai batteri trattati con IPTG a una qualsiasi delle concentrazioni testate (P < 0.05; Fig. 4). Lo stesso effetto alleviante è stato osservato per il controllo host. In termini di sopravvivenza, le cellule pre-indotte con lattosio eseguite quasi come le loro controparti non indotte (Fig. 4 quater). In linea con i risultati della placcatura, l’analisi citometrica del controllo dell’ospite e delle cellule deg31 pre-indotte con lattosio ha rivelato livelli significativamente più bassi di cellule stressate con membrane depolarizzate rispetto a quelli osservati per i ceppi di E. coli pre-indotti con IPTG (P < 0.01; File aggiuntivo 1: Fig. S10). Questi risultati hanno indicato ancora una volta che l’azione di IPTG nei ricombinanti studiati era costantemente accompagnata da cambiamenti nelle proprietà della membrana.

Una maggiore vitalità delle cellule indotte con lattosio invece di IPTG è stata precedentemente riportata per l’espressione di singole proteine eterologhe . Questo effetto è stato attribuito all’induzione ritardata e più lieve ottenuta con l’induttore naturale. A differenza dell’IPTG sintetico, che può entrare rapidamente nella cellula sia per diffusione passiva che con l’aiuto del permease del lattosio di pizzo, il lattosio può entrare nel citoplasma solo attraverso il permease. Inoltre, il lattosio deve essere convertito in allolattosio dalla β-galattosidasi prima di legarsi al repressore lac, mentre l’IPTG si lega direttamente al repressore. I nostri risultati confermano che il lattosio impone un carico metabolico inferiore rispetto all’IPTG, suggerendo che è anche un induttore più adatto per l’espressione di intere vie eterologhe in E. coli BL21(DE3). Ciò è particolarmente importante per le cellule di E. coli BL21 (DE3) che trasportano percorsi sintetici che degradano composti tossici o producono intermedi tossici.