2- L’électrophorèse D commence par une électrophorèse dans la première dimension, puis sépare les molécules perpendiculairement à la première pour créer un électrophérogramme dans la deuxième dimension. En électrophorèse dans la première dimension, les molécules sont séparées linéairement en fonction de leur point isoélectrique. Dans la deuxième dimension, les molécules sont ensuite séparées à 90 degrés du premier électrophérogramme en fonction de la masse moléculaire. Comme il est peu probable que deux molécules soient similaires dans deux propriétés distinctes, les molécules sont plus efficacement séparées en électrophorèse 2D qu’en électrophorèse 1D.
Les deux dimensions dans lesquelles les protéines sont séparées en utilisant cette technique peuvent être le point isoélectrique, la masse du complexe protéique à l’état natif ou la masse protéique.
La séparation des protéines par point isoélectrique est appelée focalisation isoélectrique (IEF). Ainsi, un gradient de pH est appliqué sur un gel et un potentiel électrique est appliqué à travers le gel, rendant une extrémité plus positive que l’autre. À toutes les valeurs de pH autres que leur point isoélectrique, les protéines seront chargées. S’ils sont chargés positivement, ils seront tirés vers l’extrémité la plus négative du gel et s’ils sont chargés négativement, ils seront tirés vers l’extrémité la plus positive du gel. Les protéines appliquées dans la première dimension se déplaceront le long du gel et s’accumuleront à leur point isoélectrique; c’est-à-dire le point auquel la charge globale sur la protéine est 0 (une charge neutre).
Pour l’analyse du fonctionnement des protéines dans une cellule, la connaissance de leur coopération est essentielle. Le plus souvent, les protéines agissent ensemble en complexes pour être pleinement fonctionnelles. L’analyse de cette organisation sous-organite de la cellule nécessite des techniques de conservation de l’état natif des complexes protéiques. En électrophorèse native sur gel de polyacrylamide (PAGE native), les protéines restent à l’état natif et sont séparées dans le champ électrique suivant respectivement leur masse et la masse de leurs complexes. Pour obtenir une séparation par taille et non par charge nette, comme dans l’IEF, une charge supplémentaire est transférée aux protéines par l’utilisation de bleu Brillant de Coomassie ou de dodécylsulfate de lithium. Après l’achèvement de la première dimension, les complexes sont détruits en appliquant la SDS-PAGE dénaturante dans la deuxième dimension, où les protéines dont sont composés les complexes sont séparées par leur masse.
Avant de séparer les protéines en masse, elles sont traitées avec du dodécylsulfate de sodium (SDS) avec d’autres réactifs (SDS-PAGE en 1-D). Cela dénature les protéines (c’est-à-dire qu’il les déplie en molécules longues et droites) et lie un certain nombre de molécules SDS à peu près proportionnelles à la longueur de la protéine. Parce que la longueur d’une protéine (lorsqu’elle est dépliée) est à peu près proportionnelle à sa masse, cela équivaut à dire qu’elle attache un certain nombre de molécules SDS à peu près proportionnelles à la masse de la protéine. Puisque les molécules de SDS sont chargées négativement, le résultat de ceci est que toutes les protéines auront approximativement le même rapport masse/charge les unes que les autres. De plus, les protéines ne migrent pas lorsqu’elles ne sont pas chargées (résultat de l’étape de focalisation isoélectrique) donc l’enrobage de la protéine dans SDS (chargée négativement) permet la migration des protéines dans la deuxième dimension (SDS-PAGE, elle n’est pas compatible pour une utilisation dans la première dimension car elle est chargée et un détergent non ionique ou zwitterionique doit être utilisé). Dans la deuxième dimension, un potentiel électrique est à nouveau appliqué, mais à un angle de 90 degrés par rapport au premier champ. Les protéines seront attirées vers le côté le plus positif du gel (car le SDS est chargé négativement) proportionnellement à leur rapport masse/ charge. Comme expliqué précédemment, ce rapport sera presque le même pour toutes les protéines. La progression des protéines sera ralentie par les forces de frottement. Le gel agit donc comme un tamis moléculaire lorsque le courant est appliqué, séparant les protéines sur la base de leur poids moléculaire, les protéines plus grosses étant retenues plus haut dans le gel et les protéines plus petites pouvant passer à travers le tamis et atteindre des régions inférieures du gel.