Chromatographie par filtration sur gel

Applications de chromatographie par filtration sur gel

La chromatographie par filtration sur gel, un type de chromatographie d’exclusion de taille, peut être utilisée pour fractionner des molécules et des complexes dans un échantillon en fractions avec une plage de taille particulière, pour éliminer toutes les molécules plus grandes qu’une taille particulière de l’échantillon, ou une combinaison des deux opérations. La chromatographie par filtration sur gel peut être utilisée pour séparer des composés tels que de petites molécules, des protéines, des complexes protéiques, des polysaccharides et des acides nucléiques en solution aqueuse. Lorsqu’un solvant organique est utilisé comme phase mobile, le procédé est plutôt appelé chromatographie par perméation de gel.

La chromatographie par filtration sur gel peut également être utilisée pour:

• Fractionnement de molécules et de complexes dans une plage de taille prédéterminée
• Analyse et détermination de la taille
• Élimination de grandes protéines et complexes
• Échange de tampons
• Dessalement
• Élimination de petites molécules telles que des nucléotides, des amorces, des colorants et des contaminants
• Évaluation de la pureté de l’échantillon
• Séparation des radio-isotopes liés des radio-isotopes non liés

Les supports de chromatographie par filtration sur gel pour toutes les utilisations ci-dessus sont disponibles dans des colonnes d’écoulement gravitaire préemballées, des colonnes d’essorage, à basse pression et colonnes de chromatographie moyenne pression et résines embouteillées.

Mécanisme de chromatographie par filtration sur gel

Dans une colonne de chromatographie par filtration sur gel, la phase stationnaire est composée d’une matrice poreuse et la phase mobile est le tampon qui circule entre les billes de matrice. Les billes ont une plage de taille de pores définie, connue sous le nom de plage de fractionnement. Les molécules et les complexes trop gros pour pénétrer dans les pores restent dans la phase mobile et se déplacent dans la colonne avec le flux du tampon. Les molécules et les complexes plus petits qui sont capables de se déplacer dans les pores entrent dans la phase stationnaire et se déplacent à travers la colonne de filtration sur gel par un chemin plus long à travers les pores des perles.

Toute molécule ou complexe qui est au-dessus de la plage de fractionnement pour une colonne de chromatographie par filtration sur gel particulière se déplacera dans la colonne plus rapidement que toute molécule pouvant entrer dans la phase stationnaire. Par conséquent, tout constituant de l’échantillon qui se trouve au-dessus de la plage de fractionnement élut en premier (dans le volume vide) avant tout ce qui se trouve dans la plage de fractionnement. La taille minimale qui restera dans la phase mobile et n’entrera pas dans la phase stationnaire est connue sous le nom de limite d’exclusion. Bio-Rad propose des supports et des colonnes de chromatographie par filtration sur gel avec des limites d’exclusion allant de plus de trois ordres de grandeur, de 100 daltons à 100 000 daltons (100 kDa).

Les molécules et complexes pouvant entrer dans la phase stationnaire seront fractionnés en fonction de leurs tailles. Les molécules plus petites migreront profondément dans les pores et seront plus retardées que les molécules plus grosses qui ne pénètrent pas si facilement dans les pores, et sont ainsi éluées de la colonne plus rapidement. Cette différence dans la migration des pores conduit au fractionnement des composants par taille avec la plus grande élution en premier.

Dans les colonnes de chromatographie par filtration sur gel conçues pour le dessalage, l’échange de tampons et l’élimination de petites molécules telles que les nucléotides, les sels et les petits composés pénètrent facilement dans les pores, sont retardés et migrent plus lentement à travers la colonne que les protéines ou les acides nucléiques plus gros. Par conséquent, les composants d’intérêt dans l’échantillon sont élués à l’avance des sels, des nucléotides, etc. Les kits de nettoyage de l’ADN utilisant ce mécanisme contiennent souvent des colonnes de spin de filtration sur gel.

La résolution, ici définie comme la netteté des limites entre les fractions de taille, est déterminée par la taille des billes et un certain nombre d’autres facteurs. Une taille de perle plus petite donne généralement une résolution plus élevée dans une colonne de chromatographie par filtration sur gel. Les molécules compactes diffusent à travers la phase stationnaire plus rapidement que les molécules linéaires. L’exclusion de taille, la plage de fractionnement et le taux d’élution sont affectés par la composition du tampon, la force ionique et le pH. Pour le fractionnement de mélanges complexes de protéines, les temps d’élution et les limites d’exclusion de taille peuvent devoir être déterminés empiriquement.

Milieux de chromatographie par filtration sur gel

Un critère important pour les milieux de chromatographie par filtration sur gel est que les milieux sont inertes et que rien dans l’échantillon ni aucun tampon ne se lie au milieu. Une autre considération est le type de colonne de filtration sur gel utilisée et si elle est utilisée dans un système de chromatographie sous pression ou dans des colonnes à flux gravitaire ou à spin. Si un système de chromatographie sous pression est utilisé, la colonne et le support doivent pouvoir tolérer la pression et les débits utilisés.

Les milieux couramment utilisés pour la chromatographie par filtration sur gel sont à base de billes d’agarose ou de polyacrylamide, de dextrose pour les systèmes par gravité ou à basse pression et de résines polymères pour les systèmes à moyenne pression. Le choix du support dépend des propriétés des composants à séparer et d’autres facteurs expérimentaux. Les considérations suivantes sont générales lors de la détermination du choix du support de chromatographie par filtration sur gel:

• Plage de fractionnement
• Limite d’exclusion de taille
• Pression de service
• Débit
• Viscosité de l’échantillon
• Plage de pH
• Autoclavabilité
• Tolérance pour la mise à l’eau solvants organiques; certains échantillons peuvent être plus solubles dans un mélange eau-organique
• Tolérance pour les détergents, les agents chaotropes, le formamide, etc.
• Température de fonctionnement

Les types d’échantillons, le choix du support et la configuration du système de chromatographie détermineront les paramètres les plus importants pour une application de purification donnée.