1 Introduction
Les gènes des protéines transmembranaires (TMP) représentent 20 à 30% de la plupart des génomes (Wallin & Heijne, 1998), et compte tenu de leurs rôles critiques dans la physiologie cellulaire, les TMP sont les cibles d’une grande fraction des médicaments cliniquement utiles. Ainsi, la détermination de leurs structures et modes d’action revêt une importance considérable. Cependant, le nombre de structures TMP haute résolution disponibles reste relativement faible (voir la page Web de Stephen White ; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Deux explications fréquemment invoquées pour expliquer la difficulté d’obtenir des cristaux bien diffractants de TMPs pour une utilisation dans les études de diffraction des rayons X sont (1) Les TMPs sont structurellement dynamiques avec des régions flexibles qui rendent difficile l’adoption par la protéine de la conformation uniforme requise pour l’emballage en cristal; et (2) les surfaces des régions transmembranaires de TMPs ne participent pas aussi facilement que les surfaces des protéines solubles globulaires aux interactions protéine-protéine nécessaires à l’emballage en cristal. L’introduction d’une protéine soluble stable dans une région exposée à la surface d’un TMP permet de contourner potentiellement ces deux problèmes, car une telle insertion à un emplacement interne dans un TMP peut réduire la flexibilité globale et la présence d’un domaine soluble facilement cristallisable peut fournir des contacts intermoléculaires nécessaires à la cristallisation (Chun et al., 2012; Engel, Chen, & Privé, 2002).
La fusion du lysozyme T4 (T4L) à des emplacements internes dans les PGT a, à ce jour, fourni une approche réussie pour la détermination des structures de divers membres de l’importante superfamille des RCPG (Cherezov et al., 2007; Chien et coll., 2010; Dore et coll., 2014; Fenalti et coll., 2014; Granier et coll., 2012; Haga et coll., 2012; Hanson et coll., 2012; Hollenstein et coll., 2013; Jaakola et coll., 2008; Kruse et coll., 2012; Manglik et coll., 2012; Rosenbaum et coll., 2007, 2011; Shimamura et coll., 2011; Tan et coll., 2013; Wacker et coll., 2013; Wang et coll., 2013; White et coll., 2012; Wu et coll., 2010, 2012; Xu et coll., 2011; Zhang et coll., 2012). Fusions internes similaires d’un apocytochrome b stabilisé thermiquement (Wacker et al., 2013; Wang et coll., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et coll., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014) et la rubredoxine (Tan et al., 2013) ont également donné des structures GPCR. De plus, plusieurs structures GPCR ont été obtenues par cristallisation de constructions dans lesquelles le partenaire protéique stabilisant était fusionné à l’extrémité N-terminale de la séquence réceptrice, plutôt qu’à une position interne (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ues et coll., 2013; Thompson et coll., 2012; Wu et coll., 2014), suggérant que le rôle des protéines de fusion dans la facilitation de la formation de contacts intermoléculaires pourrait être plus important pour favoriser la cristallisation que la réduction de la flexibilité de la TMP. D’autres approches pour obtenir des structures GPCR qui n’impliquent pas l’utilisation de protéines de fusion ont inclus la cocristallisation avec des anticorps anti-récepteurs (Kruse et al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et coll., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et coll., 2013) et la cristallisation de variants de GPCR qui ont été thermostabilisés par l’introduction de mutations ponctuelles et de délétions (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). En fait, la plupart des variantes de GPCR contenant des protéines de fusion utilisées pour une détermination réussie de la structure ont également incorporé des mutations ponctuelles et des troncations conçues pour améliorer davantage la stabilité des protéines et réduire la flexibilité.
L’insertion de protéines solubles stables dans les TMP dans le but de favoriser la cristallisation a généralement été effectuée en tant qu’insertion ou remplacement de résidus dans la troisième boucle intracellulaire (IC3) des GPCR. Ceci est basé sur l’espoir que cette région des récepteurs est flexible et peut contrôler le mouvement relatif des hélices environnantes (Rosenbaum et al., 2007), ainsi que la réduction de la probabilité que l’insertion du partenaire de fusion perturbe la structure globale du GPCR (Chun et al., 2012). Bien que de telles insertions ne perturbent souvent pas les structures globales des récepteurs (basées sur la rétention d’au moins une certaine affinité de liaison aux ligands par les constructions de fusion), elles entraînent généralement une perte de la capacité d’activer la protéine G trimérique apparentée (Rosenbaum et al., 2007), ce qui n’est pas surprenant puisque la boucle IC3 est souvent le site d’interactions fonctionnelles entre les RCPG et les protéines G trimériques qui sont leurs effecteurs immédiats en aval. De plus, les critères d’établissement de sites de jonction particuliers pour l’insertion de protéines de fusion et pour déterminer la quantité de séquence de récepteurs qu’elles remplacent ne sont pas bien établis. Une fusion réussie doit fournir une correspondance optimale entre l’espacement et l’orientation des terminaisons N et C de la protéine insérée et les sites de jonction dans le GPCR (Chun et al., 2012; Engel et coll., 2002). Ainsi, la création d’une fusion utile peut nécessiter la synthèse ou la construction de plusieurs versions de gènes fusionnés (Rosenbaum et al., 2007).
Nous décrivons ici une stratégie de génération et de criblage d’une bibliothèque de formes variantes d’un récepteur contenant des insertions de T4L en différents points de la troisième boucle intracellulaire (IC3) en remplacement de différents nombres de résidus d’acides aminés dans la séquence de boucle (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). En exprimant des récepteurs dans la levure, il est possible de créer des banques randomisées de variants avec des insertions de lysozyme et de cribler directement les constructions avec des niveaux d’expression globaux maximaux, le nombre de sites de liaison des ligands à la surface cellulaire et même la fonction des récepteurs, dosés sur la base de l’activation de la protéine G apparentée. Les approches ont réussi à identifier des récepteurs avec des insertions dans la boucle IC3 qui conservent une fonction de signalisation presque complète. Ceci suggère que, lorsqu’elle est attachée via des séquences de liaison appropriées, la molécule T4L peut être insérée dans cette boucle sans empêcher l’accès de la protéine G aux surfaces pertinentes du récepteur activé.
Les protocoles décrits ont été développés à l’aide de Ste2p, un GPCR endogène de la levure Saccharomyces cerevisiae utilisé comme système initial traçable pour lequel aucune structure tridimensionnelle n’est encore disponible. Cependant, des approches similaires pourraient être utilisées pour identifier des variantes contenant des insertions des nombreux RCPG de mammifères susceptibles d’activer la voie de réponse aux phéromones de levure (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), ou à d’autres PGT pour lesquels il est possible de tester leur fonction dans des cellules intactes. De plus, des espèces de levure ont été utilisées comme systèmes d’expression pour la détermination de la structure des RCPG et d’autres PGT (Clark et al., 2010), notamment pour la détermination de la structure cristalline du récepteur humain de l’histamine H1 (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p est le récepteur du facteur α de la phéromone d’accouplement de la levure, un peptide à 13 résidus. La liaison de ce ligand entraîne l’activation d’une protéine G hétérotrimérique cytoplasmique, qui, à son tour, active une voie MAP kinase, conduisant finalement à des réponses transcriptionnelles, à des changements de forme cellulaire, à l’arrêt du cycle cellulaire et à la fusion avec des cellules de levure du type d’accouplement opposé.