Ingegneria dei tessuti: come costruire un cuore

Doris Taylor non la prende come un insulto quando la gente la chiama Dottor Frankenstein. “In realtà è stato uno dei complimenti più grandi che ho ottenuto”, dice — un’affermazione che la sua ricerca sta spingendo i confini del possibile. Data la natura del suo lavoro come direttore della ricerca di medicina rigenerativa presso il Texas Heart Institute di Houston, Taylor deve ammettere che il confronto è adatto. Raccoglie regolarmente organi come cuori e polmoni dai nuovi morti, li riprogetta partendo dalle cellule e tenta di riportarli in vita nella speranza che possano battere o respirare di nuovo nei vivi.

Taylor è all’avanguardia dei ricercatori che cercano di progettare interi nuovi organi, per consentire i trapianti senza il rischio di rigetto da parte del sistema immunitario del ricevente. La strategia è abbastanza semplice in linea di principio. Prima rimuovere tutte le cellule da un organo morto-non deve nemmeno essere da un essere umano – quindi prendere l’impalcatura proteica lasciata indietro e ripopolarla con cellule staminali immunologicamente abbinate al paziente bisognoso. Voilà! La penuria paralizzante di organi trapiantabili in tutto il mondo è risolta.

Nella pratica, tuttavia, il processo è afflitto da enormi sfide. I ricercatori hanno avuto un certo successo con la coltivazione e il trapianto di organi cavi, relativamente semplici come trachee e vesciche (vedi go.nature.com/zvuxed). Ma crescere organi solidi come reni o polmoni significa ottenere dozzine di tipi di cellule esattamente nelle giuste posizioni e contemporaneamente crescere reti complete di vasi sanguigni per mantenerli in vita. I nuovi organi devono essere sterili, in grado di crescere se il paziente è giovane e almeno nominalmente in grado di ripararsi. Soprattutto, devono lavorare-idealmente, per tutta la vita. Il cuore è il terzo organo più necessario dopo il rene e il fegato, con una lista d’attesa di circa 3.500 solo negli Stati Uniti, ma pone sfide extra per il trapianto e la bioingegneria. Il cuore deve battere costantemente per pompare circa 7.000 litri di sangue al giorno senza un back-up. Ha camere e valvole costruite da diversi tipi di cellule muscolari specializzate chiamate cardiomiociti. E i cuori dei donatori sono rari, perché sono spesso danneggiati da malattie o sforzi di rianimazione, quindi una fornitura costante di organi bioingegnerizzati sarebbe benvenuta.

Taylor, che ha condotto alcuni dei primi esperimenti di successo per costruire cuori di ratto1, è ottimista su questa sfida finale nell’ingegneria tissutale. “Penso che sia eminentemente fattibile”, dice, aggiungendo rapidamente, ” Non penso che sia semplice.”Alcuni colleghi sono meno ottimisti. Paolo Macchiarini, chirurgo toracico e scienziato del Karolinska Institute di Stoccolma, che ha trapiantato trachee bioingegnerizzate in diversi pazienti, afferma che sebbene l’ingegneria tissutale possa diventare una routine per sostituire strutture tubolari come trachee, arterie ed esofagi, “non è sicuro che ciò accadrà con organi più complessi”.

Eppure lo sforzo può essere utile anche se fallisce, dice Alejandro Soto-Gutiérrez, ricercatore e chirurgo presso l’Università di Pittsburgh in Pennsylvania. “Oltre al sogno di creare organi per il trapianto, ci sono molte cose che possiamo imparare da questi sistemi”, dice — tra cui una migliore comprensione di base dell’organizzazione cellulare nel cuore e nuove idee su come risolverne uno.

NIK SPENCER / NATURA

L’impalcatura

Per più di un decennio, i biologi sono stati in grado di trasformare le cellule staminali embrionali in cellule muscolo-cardiache che battono in un piatto. Con un po ‘ di pacemaking elettrico dall’esterno, queste cellule cardiache ingegnerizzate cadono persino in fase e mantengono il battito sincrono per ore.

Ma per passare da chiazze che si contraggono in una capsula di Petri a un cuore funzionante, occorre un’impalcatura per organizzare le cellule in tre dimensioni. I ricercatori potrebbero infine essere in grado di creare tali strutture con la stampa tridimensionale-come è stato dimostrato all’inizio di quest’anno con una trachea2 artificiale (vedi Nature http://doi.org/m2q; 2013). Per il prossimo futuro, tuttavia, la complessa struttura del cuore umano è fuori dalla portata anche delle macchine più sofisticate. Ciò è particolarmente vero per le intricate reti di capillari che devono fornire al cuore ossigeno e sostanze nutritive e rimuovere i prodotti di scarto dal profondo dei suoi tessuti. “La vascolarizzazione è la sfida principale”, afferma Anthony Atala, urologo della Wake Forest University di Winston-Salem, North Carolina, che ha impiantato vesciche bioingegnerizzate nei pazienti3 e sta lavorando alla costruzione di reni (vedi Nature http://doi.org/dw856h; 2006).

Le principali tecniche per aspiranti costruttori di cuore in genere implicano il riutilizzo di ciò che la biologia ha già creato. Un buon posto per vedere come questo è fatto è Massachusetts General Hospital di Boston, dove Harald Ott, un chirurgo e ricercatore di medicina rigenerativa, dimostra un metodo che ha sviluppato durante la formazione sotto Taylor a metà degli anni 2000.

Sospeso da tubi di plastica in una camera a forma di tamburo in vetro e plastica è un cuore umano fresco. Nelle vicinanze c’è una pompa che sta spingendo tranquillamente il detersivo attraverso un tubo che entra nell’aorta del cuore. Il flusso costringe la valvola aortica chiusa e invia il detergente attraverso la rete di vasi sanguigni che alimentavano il muscolo fino a quando il suo proprietario è morto pochi giorni prima. Nel corso di circa una settimana, spiega Ott, questo flusso di detersivo toglierà lipidi, DNA, proteine solubili, zuccheri e quasi tutto l’altro materiale cellulare dal cuore, lasciando solo una maglia pallida di collagene, laminine e altre proteine strutturali: la ‘matrice extracellulare’ che una volta teneva insieme l’organo.

Il cuore dell’impalcatura non deve essere umano. I maiali sono promettenti: portano tutti i componenti cruciali della matrice extracellulare, ma è improbabile che portino malattie umane. E i loro cuori sono raramente indeboliti dalla malattia o dagli sforzi di rianimazione. “I tessuti di maiale sono molto più sicuri degli esseri umani e c’è una fornitura illimitata”, afferma Stephen Badylak, ricercatore di medicina rigenerativa presso l’Università di Pittsburgh.

La parte difficile, dice Ott, è assicurarsi che il detergente dissolva la giusta quantità di materiale. Striscia via troppo poco, e la matrice potrebbe trattenere alcune delle molecole di superficie cellulare che possono portare al rigetto da parte del sistema immunitario del ricevente. Striscia via troppo, e potrebbe perdere proteine vitali e fattori di crescita che dicono le cellule di nuova introduzione dove aderire e come comportarsi. “Se è possibile utilizzare un agente più mite e un lasso di tempo più breve, si ottiene più di una risposta rimodellante”, afferma Thomas Gilbert, che studia la decellolarizzazione presso ACell, una società di Columbia, nel Maryland, che produce prodotti a matrice extracellulare per la medicina rigenerativa.

Attraverso tentativi ed errori, aumentando la concentrazione, i tempi e la pressione dei detergenti, i ricercatori hanno affinato il processo di decellularizzazione su centinaia di cuori e altri organi. È probabilmente la fase più sviluppata dell’impresa che genera organi, ma è solo il primo passo. Successivamente, l’impalcatura deve essere ripopolata con cellule umane.

Le cellule

‘Recellularization’ introduce un’altra sfilza di sfide, dice Jason Wertheim, un chirurgo presso la Feinberg School of Medicine della Northwestern University di Chicago, Illinois. “Uno, quali cellule usiamo? Due, quante cellule usiamo? E tre, dovrebbero essere cellule mature, cellule staminali embrionali, cellule iPS? Qual è la fonte cellulare ottimale?”

L’utilizzo di cellule mature è a dir poco complicato, afferma Taylor. “Non puoi far proliferare i cardiociti adulti”, dice. “Se potessi, non staremmo avendo questa conversazione a tutti” – perché i cuori danneggiati potrebbero riparare se stessi e non ci sarebbe bisogno di trapianti.

La maggior parte dei ricercatori nel campo utilizza una miscela di due o più tipi di cellule, come le cellule precursori endoteliali per allineare i vasi sanguigni e i progenitori muscolari per seminare le pareti delle camere. Ott ha derivato questi da cellule iPS-cellule adulte riprogrammate in uno stato embrionale-stem-cell-like utilizzando fattori di crescita — perché questi possono essere prelevati da un paziente bisognoso e utilizzati per produrre tessuti immunologicamente abbinati.

In linea di principio, l’approccio iPS-cell potrebbe fornire al nuovo cuore la sua suite completa di tipi di cellule, comprese le cellule vascolari e diverse varietà di cellule muscolo-cardiache. Ma in pratica, si imbatte nei propri problemi. Uno è la dimensione di un cuore umano. I numeri sono seriamente sottovalutati, dice Ott. “Una cosa è fare un milione di cellule ;un’altra è fare 100 milioni o 50 miliardi di cellule.”E i ricercatori non sanno se i tipi di cellule giuste cresceranno quando le cellule iPS vengono utilizzate per ricapitolare lo sviluppo embrionale in un’impalcatura cardiaca adulta.

OTT LAB / MASSACHUSETTS GENERAL HOSPITAL

Un cuore umano decellularizzato attende la ricostruzione con un’iniezione di cellule precursori.

Mentre colonizzano l’impalcatura, alcune delle cellule immature metteranno radici e inizieranno a crescere. Ma esortandoli a diventare funzionali, battendo cardiomiociti richiede più di media ossigenati e fattori di crescita. “Le cellule percepiscono il loro ambiente”, dice Angela Panoskaltsis-Mortari, che ha cercato di costruire polmoni per il trapianto presso l’Università del Minnesota a Minneapolis. “Non percepiscono solo i fattori. Percepiscono la rigidità e lo stress meccanico” , che a sua volta spinge le cellule lungo il loro corretto percorso di sviluppo.

Quindi i ricercatori devono mettere il cuore in un bioreattore che imiti la sensazione di battere. I bioreattori Ott utilizzano una combinazione di segnali elettrici — simile a un pacemaker — per aiutare a sincronizzare i cardiomiociti battenti seminati sull’impalcatura, combinati con movimenti fisici di battitura indotti da una pompa (vedi “Organi personalizzati”). Ma i ricercatori devono affrontare una battaglia costante nel tentativo di scimmiottare le condizioni presenti nel corpo umano, come i cambiamenti nella frequenza cardiaca e la pressione sanguigna, o la presenza di farmaci. “Il corpo reagisce alle cose e cambia le condizioni così rapidamente che è probabilmente impossibile imitarlo in un bioreattore”, afferma Badylak.

Quando Taylor e Ott stavano sviluppando per la prima volta bioreattori, per cuori di ratto decellullarizzati e ripopolati, dovevano imparare mentre andavano avanti. “C’era un sacco di nastro adesivo in laboratorio”, dice Ott. Ma alla fine i cuori sono stati in grado di battere da soli dopo otto-dieci giorni nel bioreattore, producendo circa il 2% della capacità di pompaggio di un normale cuore di ratto adulto1. Taylor dice che da allora ha ottenuto cuori da ratti e mammiferi più grandi per pompare con ben il 25% della capacità normale, anche se non ha ancora pubblicato i dati. Lei e Ott sono fiduciosi di essere sulla strada giusta.

Il battito

La sfida finale è una delle più difficili: mettere un cuore appena cresciuto e ingegnerizzato in un animale vivente e mantenerlo battere a lungo.

L’integrità della vascolarizzazione è la prima barriera. Qualsiasi pezzo nudo di matrice serve come terreno fertile per coaguli che potrebbero essere fatali per l’organo o l’animale. “Avrai bisogno di un endotelio abbastanza intatto che riveste ogni nave o avrai coagulazione o perdite”, dice Gilbert.

Ott ha dimostrato che gli organi ingegnerizzati possono sopravvivere per un certo tempo. Il suo gruppo ha trapiantato un singolo polmone bioingegnerizzato in un ratto, dimostrando che potrebbe sostenere lo scambio di gas per l’animale, ma lo spazio aereo abbastanza rapidamente riempito di fluidi4. E un trapianto di rene di ratto ingegnerizzato che il gruppo di Ott ha riportato all’inizio di quest’anno è sopravvissuto senza coagulazione, ma ha avuto solo una minima capacità di filtrare l’urina, probabilmente perché il processo non aveva prodotto abbastanza dei tipi di cellule necessari per il kidney5 (vedi Nature http://doi.org/m2r; 2013). La squadra di Ott e altri hanno impiantato cuori ricostruiti nei ratti, generalmente nel collo, nell’addome o accanto al cuore dell’animale. Ma anche se i ricercatori possono nutrire gli organi con il sangue e farli battere per un po’, nessuno dei cuori è stato in grado di supportare la funzione di pompaggio del sangue. I ricercatori devono dimostrare che un cuore ha una capacità di funzionamento molto più elevata prima di poterlo trapiantare in un animale più grande di un ratto.

Con il cuore, dice Badylak, “devi iniziare con qualcosa che possa funzionare abbastanza bene” dal momento in cui il trapianto è a posto. “Non puoi avere qualcosa che pompi solo l’ 1 o il 2 o il 5% della frazione di eiezione del cuore normale e aspettarti di fare la differenza”, dice, riferendosi a una misura comune dell’efficienza di pompaggio. C’è poco spazio per l’errore. “Stiamo solo facendo piccoli passi”, dice Panoskaltsis-Mortari. “Siamo dove le persone erano con trapianto di cuore decenni fa.”

Il processo di decellularizzazione coltivato da Ott e altri sta già informando lo sviluppo di valvole migliorate a base di tessuti e altre parti del cuore e di altri organi. Una valvola bioingegnerizzata, ad esempio, può durare più a lungo delle valvole meccaniche o dei tessuti morti perché hanno il potenziale per crescere con un paziente e ripararsi. E altri organi potrebbero non aver bisogno di essere sostituiti interamente. “Sarei sorpreso se entro i prossimi 5-7 anni non vedessi il paziente impiantato con almeno una parte di un’arteria, lobi di un polmone, lobi di un fegato”, dice Badylak.

Taylor sospetta che approcci parziali potrebbero aiutare i pazienti con gravi difetti cardiaci come la sindrome del cuore sinistro ipoplasico, in cui metà del cuore è gravemente sottosviluppato. Ripristinare l’altra metà, “ti costringe essenzialmente a costruire la maggior parte delle cose di cui hai bisogno”, dice.

E questi sforzi potrebbero tenere lezioni per lo sviluppo di terapie cellulari consegnate al cuore. I ricercatori stanno imparando, ad esempio, come le cellule cardiache si sviluppano e funzionano in tre dimensioni. In futuro, impalcature parziali, sia sintetici o da cadaveri, potrebbe consentire nuove cellule di popolare le aree danneggiate dei cuori e ripararli come patch.

I vasi di organi fluttuanti spettrali potrebbero sembrare un’eco raccapricciante della storia di Frankenstein, ma Taylor dice che il suo lavoro è un lavoro d’amore. “Ci sono alcuni giorni in cui vado, ‘Oh mio dio, in cosa sono entrato? D’altra parte, tutto quello che serve è un bambino che ti chiama, dicendo ‘Puoi aiutare mia madre? e ne vale la pena.”