Risultati e discussione
L’analisi PCR-RFLP ha rivelato modelli di restrizione compatibili con l’analisi in silico. Tutti i cani con malformazione della coda presentavano lo stesso schema (3 frammenti, 2 bande visibili), che era diverso da quello presentato dai cani con coda normale (2 frammenti, 1 banda visibile) (Fig.1). Un altro test, anch’esso basato su PCR-RFLP, è stato utilizzato con successo per identificare la stessa mutazione nel gene T dei cani, ma utilizzando un sistema di elettroforesi su gel di poliacrilammide (Gruszczynska & Czapla 2011). Le prestazioni dell’elettroforesi su gel di poliacrilammide potrebbero migliorare la risoluzione delle bande rispetto ai frammenti di DNA nel presente studio. Tuttavia, la praticità sarebbe ridotta, poiché questo sistema è più laborioso. Nel presente studio, anche se non è stato possibile visualizzare tutti i frammenti di DNA generati dopo la digestione, è stato possibile distinguere facilmente i genotipi utilizzando l’elettroforesi su gel di agarosio.
Fig.1. PCR-RFLP per il rilevamento della mutazione C189G. Marcatore di coppie di basi (M), cani affetti – coda corta (1-7) e animale con coda normale (8).
Nell’analisi di campioni sequenziati, l’eterozigosità C (citosina) G (guanina) è stata osservata nel nucleotide 189 dell’esone 1 solo nei cani con malformazione della coda. La posizione della mutazione era basata sulla sequenza mRNA del gene T disponibile nel Genbank (numero di adesione: AJ245513).
All’analisi in silico, è stata osservata anche un’alterazione dell’amminoacido 63 da isoleucina a metionina. Tutte le sequenze di DNA ottenute nel presente studio sono state depositate in Genbank con i numeri di adesione: MF495488 (coda corta), MF495489 (assenza di coda), MF495490 (assenza di coda) e MF495491 (coda normale).
Sebbene sia stato trovato un solo genotipo per la condizione attuale (CG per animali con malformazione della coda), è stata osservata una variazione fenotipica nei cani affetti, che è la dimensione della coda. Alcuni animali presentavano una coda corta (circa 3-4 vertebre) e altri mostravano assenza di coda (circa 1-2 vertebre) (Fig.2). Fenotipi simili sono stati osservati anche da Haworth et al. (2001) nei cani. Sebbene una spiegazione per questo non sia ancora nota nei cani, Buckingham et al. (2013), studiando la variazione congenita delle dimensioni della coda nei gatti, ha trovato prove di aploinsufficienza causata da mutazioni multiple nel gene T. Le mutazioni di C. 1199delC, c.1169delC e c.998delT sono state associate a diversi livelli di espressione genica, il che potrebbe spiegare i diversi fenotipi tra i cani con malformazione della coda (Buckingham et al. 2013).
Fig.2. (A)Cane che trasporta la mutazione C189G nel gene T. (B) Cane dalla stessa cucciolata senza mutazione C189G.
Il carattere ereditario della mutazione può essere evidenziato dall’analisi dell’heredogram (Fig.3) della lettiera studiata. È stato possibile verificare che la mutazione ha un modello di ereditarietà autosomica dominante. Tuttavia, nessun genotipo omozigote dominante (GG) è stato trovato nel presente studio, rafforzando le osservazioni che quando in omozigosi, il gene T mutato causa la morte fetale (Haworth et al. 2001). Hytonen et al. (2009) ha osservato che le cucciolate provenienti da incroci tra animali dalla coda normale (genotipo CC) erano del 29% più grandi delle cucciolate provenienti da incroci tra animali con coda malformata (genotipo CG). Questo risultato è compatibile con la riduzione prevista del 25% nella prole da incroci che coinvolgono alleli letali.
Fig.3. Heredogram che mostra il modello di ereditarietà della mutazione C189G nel gene T del Labrador Retriever. Incrocio tra nonni materni (I), cucciolata del cane colpito e suo incrocio con maschio normale (II) e cucciolata analizzata (III).
Mutazioni nel gene T sono state associate a malformazioni della coda in altre specie come topi e gatti (Wilson et al. 1995, Buckingham et al. 2013). E in alcuni di essi si osservano anche altri cambiamenti, come l’incontinenza urinaria e fecale nei gatti (Robinson 1993). Tuttavia, nei cani, ad oggi, è stata osservata solo malformazione della coda negli animali eterozigoti (CG) (Indrebo et al. 2008). Sebbene in alcune razze canine il fenotipo “malformazione della coda” non fosse associato alla mutazione C189G (Boston Terrier, Bulldog inglese, King Charles Spaniel, Miniature Schnauzer, Parson Russell Terrier e Rottweiler), il gran numero di razze colpite suggerisce un’antica mutazione (Hytonen et al. 2009), essendo presente nei cani ancestrali prima della formazione di molte razze. Tuttavia, l’incrocio interrazziale può anche aver contribuito alla diffusione della mutazione, poiché gli animali eterozigoti CG sembrano non avere alterazioni della libido o delle prestazioni riproduttive. Un altro fattore che potrebbe aver contribuito alla diffusione della mutazione è stato l’uso nella riproduzione di cani senza coda, quando la caudectomia estetica era ancora consentita. In questo periodo, è probabile che molti animali con agenesia della coda siano stati usati come riproduttori, poiché l’assenza di coda era desiderabile in alcune razze, contribuendo alla diffusione della mutazione.
Attualmente, la pratica della caudectomia (rimozione chirurgica della coda) è una procedura proibita in diversi paesi del mondo come quelli dell’Unione Europea e del Brasile (Haworth et al. 2001, CFMV 2013). In alcuni paesi dell’Unione Europea, test genetici per identificare la mutazione C189G nel gene T sono utilizzati per verificare se l’assenza di coda in alcune razze è di origine congenita o gli animali hanno subito un intervento chirurgico irregolare. La PCR-RFLP utilizzata nel presente studio era una tecnica semplice e accurata per identificare questa mutazione e potrebbe essere utilizzata come prova per identificare la pratica illegale di caudectomia.
A causa della scarsità di informazioni sulla mutazione C189G nel gene T dei cani, non ci sono ulteriori informazioni sulla sua associazione con altri caratteri morfologici o addirittura fisiologici, e quindi deve essere studiato.