Plasmidi 101: Codon usage bias

Un codice genetico simile è usato dalla maggior parte degli organismi sulla Terra, ma diversi organismi hanno preferenze diverse per i codoni che usano per codificare aminoacidi specifici. Questo è possibile perché ci sono 4 basi (A, T, C e G) e 3 posizioni in ogni codone. Ci sono quindi 64 codoni possibili, ma solo 20 aminoacidi e 3 codoni di arresto per codificare lasciando 41 codoni dispersi. Il risultato è la ridondanza; codoni multipli codificano singoli amminoacidi. I vincoli evolutivi hanno modellato quali codoni sono usati preferenzialmente in cui gli organismi-gli organismi hanno pregiudizi sull’uso del codone.

Puoi trovare molte tabelle di codoni che mostrano quali codoni codificano quali amminoacidi (vedi esempio a destra). Con tali semplici regole, si potrebbe pensare che sia facile a venire con una sequenza di DNA praticabile per codificare il peptide di interesse e produrre quel peptide nel vostro organismo di scelta. Sfortunatamente, le preferenze del codone lo rendono così non puoi scegliere tra i possibili codoni a caso e aspettarti che la tua sequenza esprima bene in qualsiasi organismo.

Quindi quali sono i vincoli evolutivi che portano a queste preferenze e cosa possiamo fare al riguardo? Continuate a leggere per scoprire!

Perché gli organismi hanno diversi pregiudizi sull’uso del codone?

Le ragioni delle diverse preferenze dei codoni tra gli organismi non sono completamente comprese, ma alcune possibili ragioni includono:

1. Pressioni metaboliche-ci vogliono risorse cellulari per produrre TRNA che riconoscono diversi codoni, modificano correttamente i TRNA e caricano i TRNA con gli amminoacidi appropriati. Se un organismo utilizza solo un sottoinsieme di codoni, ha solo bisogno di produrre un sottoinsieme di TRNA carichi e quindi potrebbe aver bisogno di meno risorse per l’intero processo di traduzione. Ad esempio, durante condizioni di alto tasso di crescita, E. coli sovraregola preferenzialmente la produzione di TRNA che riconoscono i codoni trovati in geni altamente espressi (Emilsson e Kurland, 1990).
2. Controllo dell’espressione genica attraverso la sequenza genica – Le proteine codificate da codoni con bassa abbondanza o TRNA scarsamente caricati possono essere prodotte ad un tasso inferiore rispetto alle proteine codificate da TRNA altamente abbondanti e carichi. Ad esempio Tuller et al. ha scoperto che l’efficienza della traduzione è ben correlata con il bias del codone sia in E. coli che in S. cerevisiae.
3. Folding proteico – Se una proteina è codificata da una miscela di codoni con TRNA altamente e scarsamente caricati, diverse regioni della proteina possono essere tradotte a velocità diverse. Il ribosoma si muoverà rapidamente lungo le regioni che richiedono TRNA abbondanti e carichi, ma si fermerà nelle regioni che richiedono bassa abbondanza, TRNA scarsamente caricati. Quando il ribosoma si blocca, questo può dare alle regioni rapidamente tradotte la possibilità di piegarsi correttamente. Ad esempio Pechmann e Frydman hanno scoperto che tratti di codoni non ottimali sono associati a specifiche strutture secondarie in 10 ceppi di lievito strettamente correlati.
4. Adattamento alle mutevoli condizioni – Gli organismi hanno spesso bisogno di esprimere geni a diversi livelli in condizioni diverse. Con vari usi di codoni, un organismo può modificare quali proteine sono altamente espresse e quali sono scarsamente espresse producendo e caricando specifici pool di tRNA. Ad esempio, i TRNA utilizzati nei geni che codificano gli enzimi biosintetici degli aminoacidi possono essere caricati preferenzialmente durante la fame di aminoacidi, con conseguente maggiore produzione di enzimi biosintetici degli aminoacidi (Dittmar et al., 2005).

In che modo il bias sull’utilizzo del codone influisce sui miei esperimenti?

Mentre le preferenze dei codoni possono essere molto utili per gli organismi, possono essere problematiche per i ricercatori che cercano di esprimere proteine in ospiti eterologi. Se si amplifica semplicemente un gene di interesse dal genoma umano, ad esempio, potrebbe non esprimersi affatto in E. coli (è possibile trovare una varietà di database che mostrano le preferenze del codone di vari organismi online). Anche se il gene viene tradotto, potrebbe non funzionare correttamente. Questo è il risultato di una mancata corrispondenza tra la preferenza del codone umano e di E. coli. Alcuni codoni comunemente usati negli esseri umani non sono affatto comuni in E. coli e viceversa. Quando si traducono questi codoni, il ribosoma può quindi bloccarsi in posizioni inappropriate o non riuscire a farlo attraverso l’intera trascrizione con conseguente produzione di proteine non funzionali e frammenti proteici rispettivamente.

Risolvere il problema del bias di utilizzo del codone – ottimizzazione del codone e l’espressione di TRNA alternativi

Ottimizzazione del codone

Con la sintesi del DNA a basso costo, uno dei principali modi in cui i ricercatori risolvono il problema della scelta del codone è risintetizzare i geni in modo tale che i loro codoni siano più appropriati per Questo è noto come ” ottimizzazione codone.”Anche se semplice in teoria, questo non è così facile come sembra. Anche per peptidi relativamente brevi, ci possono essere molti modi possibili per codificarli e ciò che costituisce il codone “appropriato” non è necessariamente ovvio.

Potresti pensare: “Sciocchezze! Dovrei solo scegliere il codone con il pool più abbondante di TRNA carichi nel mio organismo ospite per ogni aminoacido che vorrei codificare,” ma, come descritto sopra, non tutte le regioni di una proteina dovrebbero necessariamente essere tradotte rapidamente per produrre una proteina che funzioni correttamente.

Potresti quindi pensare: “Ok, mi assicurerò che le abbondanze dei codoni che scelgo per l’ospite corrispondano alle abbondanze dei codoni usati nell’organismo nativo.”Questa è forse un’idea migliore ed è stata utilizzata con successo in passato (Angov et al., 2008), ma ci sono ancora molte altre caratteristiche da considerare quando si progetta un gene completo. Un elenco non esaustivo comprende:

• Codone abbondanza relativa di tRNA affine abbondanza
• sequenze Ripetitive
• siti di Restrizione
• Sequenze inclini a creare strutture secondarie in trascritti di RNA
• Effetti sulla trascrizione (ricordate, non si tratta solo di traduzione, ad esempio, codone scelta può interrompere il legame del fattore di trascrizione siti)

Come si può immaginare, non è facile per gli esseri umani a saldo di tutti questi fattori in proprio. Fortunatamente, molti ricercatori hanno creato algoritmi di ottimizzazione del codone e società di sintesi del DNA come IDT e GenScript host online codon optimization tools. Tieni presente che, solo perché ottimizzi un gene con uno di questi strumenti, non significa necessariamente che il gene si esprimerà bene. Se ottieni una buona espressione, dovresti anche analizzare funzionalmente la proteina prodotta per assicurarti che si sia piegata correttamente.

Potresti essere in grado di evitare di ottimizzare il codone dei tuoi geni di interesse ordinando plasmidi che li contengono da Addgene. Se un plasmide ad Addgene contiene un gene che è stato codonato ottimizzato per un particolare organismo, questo a volte (ma non sempre) sarà notato nel campo “mutazione” sulla pagina plasmid (vedi plasmid 87904 per esempio). Poiché molti plasmidi disponibili da Addgene ora hanno dati di sequenza completa, raccomandiamo di analizzare direttamente le sequenze geniche per l’ottimizzazione del codone e l’idoneità per l’host di espressione prima di utilizzarli nei tuoi esperimenti.

Espressione di TRNA alternativi

Se non hai il tempo o i fondi per sintetizzare una versione ottimizzata per codoni del tuo gene di interesse, è possibile sovraesprimere TRNA a bassa abbondanza nel tuo host di espressione e quindi aumentare la loro abbondanza. Ad esempio, i ceppi commerciali di Rosetta E. coli esprimono una varietà di TRNA che si trovano normalmente a bassa abbondanza in E. coli.

Il vantaggio di produrre TRNA aggiuntivi è che è possibile utilizzare lo stesso sistema di espressione per molti geni diversi senza dover creare nuovi costrutti. Tuttavia, a causa di problemi come tassi di traduzione non corrispondenti e potenziali effetti sulla crescita cellulare, anche gli host che producono TRNA alternativi potrebbero non esprimere quantità sufficienti di proteine di interesse.

Indipendentemente dal metodo scelto per superare i problemi che circondano la scelta del codone, dovresti avere un metodo per assicurarti che le proteine che produci funzionino correttamente. La sovraespressione può comportare la produzione di globi insolubili e non funzionali di proteine note come corpi di inclusione che generalmente si separano con il pellet cellulare durante le procedure di purificazione. Anche se produci una grande quantità di proteine nel tuo ospite di espressione preferito, dovresti eseguire un test funzionale per assicurarti che la tua proteina non formi corpi di inclusione e si pieghi correttamente.

1. Angov, Evelina, et al. “L’espressione proteica eterologa è migliorata armonizzando le frequenze di utilizzo del codone del gene bersaglio con quelle dell’ospite di espressione.”PLoS one 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PMCID centrale PubMed: PMC2364656.

2. Dittmar, Kimberly A., et al. “Carica selettiva di isoaccettori tRNA indotti dalla fame di aminoacidi.”EMBO reports 6.2 (2005): 151-157. PubMed PMID: 15678157. PMCID centrale PubMed: PMC1299251.

3. Il suo nome deriva dal greco antico. “Tasso di crescita dipendenza di trasferimento RNA abbondanza in Escherichia coli.”The EMBO journal 9.13 (1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611. PMCID centrale PubMed: PMC552224.

4. Il film è stato prodotto dalla Warner Bros. “Codon bias and heterologous protein expression.”Trends in biotechnology 22.7 (2004): 346-353. PubMed PMID: 15245907.

5. Maertens, Barbara, et al. “Meccanismi di ottimizzazione genica: uno studio multi-gene rivela un alto tasso di successo di proteine umane a lunghezza intera espresse in Escherichia coli.”Protein Science 19.7 (2010): 1312-1326. PubMed PMID: 20506237. PMCID centrale PubMed: PMC2970903.

6. Pechmann, Sebastian e Judith Frydman. “La conservazione evolutiva dell’ottimalità del codone rivela le firme nascoste della piegatura cotranslazionale.”Nature structural & molecular biology20. 2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PMCID centrale PubMed: PMC3565066.

7. Quax, Tessa EF, et al. “Codon bias come mezzo per mettere a punto l’espressione genica.”Molecular cell 59.2 (2015): 149-161. PubMed PMID: 26186290. PMCID centrale PubMed: PMC4794256.

• Questa recensione fornisce una grande panoramica del bias di utilizzo del codone

8. Tuller, Tamir, et al. “L’efficienza di traduzione è determinata sia dal bias del codone che dall’energia di piegatura.”Proceedings of the National Academy of Sciences 107.8 (2010): 3645-3650. PubMed PMID: 20133581. PMCID centrale PubMed: PMC2840511.