Associazioni di malattie CNV
L’effetto delle CNV sull’espressione genica e i loro effetti potenzialmente dirompenti sulla struttura e sulla funzione genica suggeriscono che è probabile che possano dare un contributo considerevole alle malattie umane. A causa della scoperta relativamente recente di CNV, tuttavia, e delle attuali limitazioni nelle tecniche ad alta produttività, la piena estensione delle associazioni di malattie CNV non è ancora chiara. Tuttavia, dal numero crescente di casi in cui tali associazioni sono state dimostrate, è probabile che apportino un contributo sostanziale alla malattia umana.
Dato l’elevato numero di geni sovrapposti dai CNV (Tabella (Table1),1), è probabile che una percentuale significativa di geni biomedicamente rilevanti ne risenta. Nel nostro studio di scoperta CNV, ad esempio, quasi la metà dei geni che intersecano le varianti sono stati rappresentati nel database OMIM, compresi i geni associati a malattie mendeliane, disturbi genomici e malattie comuni (de Smith et al., 2007). Infatti, molti cambiamenti del numero di copie del gene contribuiscono direttamente alle malattie monogeniche. Nelle malattie recessive, l’emizigosità dovuta alla delezione di un gene, o parte di un gene, potrebbe smascherare una mutazione sull’altra copia del gene. Al contrario, la duplicazione di una copia genica sana su un cromosoma potrebbe teoricamente mascherare gli effetti di una mutazione che causa la malattia nel gene sull’altro cromosoma, salvando così il fenotipo. In effetti, è stato previsto che una percentuale della penetranza variabile mostrata da molte malattie genetiche dominanti potrebbe essere spiegata dai CNV (Beckmann et al., 2007).
La malattia di Alzheimer a esordio precoce autosomica dominante (ADEOAD) è nota per essere causata da mutazioni missense nei geni APP sul cromosoma 21, ma la duplicazione del locus APP è stata trovata anche in pazienti con questo disturbo (Rovelet-Lecrux et al., 2006). Questo guadagno di numero di copia è pensato per condurre ad un’abbondanza di depositi dell’amiloide nel cervello. Allo stesso modo, la triplicazione del gene SNCA, che porta a una profusione di corpi di Lewy, è stata associata a pazienti con malattia di Parkinson autosomica dominante (Singleton et al., 2003). Nessuno di questi geni è noto per essere sovrapposto da varianti in individui sani e questi guadagni di numero di copia sono, quindi, pensati per essere alla base della malattia: tali caratteristiche sono chiamate mutazioni del numero di copia (CNMs). La perdita o il guadagno di materiale esonico potrebbe anche causare mutazioni missense o frameshifts: infatti la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è solitamente causata da delezioni e duplicazioni de novo con conseguente frameshifts. Se questi sono stati scoperti per la prima volta oggi, sarebbero conosciuti come CNMs. È importante sottolineare che la maggior parte delle strategie di sequenziamento per l’identificazione delle mutazioni che causano malattie monogeniche mancherebbero tali varianti, che potrebbero quindi rappresentare una percentuale significativa di mutazioni “mancanti” e complicare la consulenza genetica.
Oltre alle malattie monogeniche, le variazioni nel numero di copie di grandi regioni genomiche sono la causa sottostante di molti disturbi genomici e tali aberrazioni possono influenzare il numero di copie di più geni. In alcuni casi, si pensa che i cambiamenti di dosaggio di molti geni contribuiscano al fenotipo, ad esempio con ∼1.Delezione 6-Mb al cromosoma 7q11.23 che porta alla sindrome di Williams-Beuren (Peoples et al., 2000). In altri disturbi, come CMT1A e SMS, si pensa che le variazioni di dosaggio in un solo gene siano alla base della malattia (Roa et al., 1991; Slager et al., 2003). L’interpretazione dei dati derivati dalle indagini cliniche sulla causa sottostante di sospetti disturbi genomici è spesso complicata dalla presenza di CNV. Non abbiamo ancora un pieno apprezzamento del normale spettro di variazione del numero di copie, in particolare nei gruppi di popolazione non HapMap (The International HapMap Consortium, 2003), e quindi potrebbe essere molto difficile distinguere tra CNV benigni e varianti che causano malattie. Ulteriori complicazioni possono essere causate da CNV che sovrappongono aberrazioni più grandi, in modo che diverse combinazioni di varianti mitigano o peggiorano i fenotipi. Questo potrebbe aiutare a spiegare, ad esempio, le diverse manifestazioni di fenotipi osservate nei pazienti con trisomia 21: ad esempio, patients il 40% dei pazienti ha difetti cardiaci congeniti (Freeman et al., 1998) e ∼1% sviluppano leucemia (Zipursky et al., 1992).
La situazione per quanto riguarda la malattia complessa è ancora meno semplice. I recenti progressi nell’analisi delle malattie complesse, utilizzando approcci di associazione SNP a livello genomico, hanno evidenziato nuovi geni e potenziali vie patogene (Frayling et al., 2007; Sladek et al., 2007), ma i marcatori SNP trovati ancora non tengono conto dell’ereditabilità stimata di questi disturbi. È probabile, quindi, che altri fattori genetici contribuiscano a disturbi complessi comuni, tra cui varianti rare, modificazioni epigenetiche e variazione del numero di copie. Sebbene i CNV si sovrappongano a molti geni biologicamente importanti, molti dei quali erano già associati alla malattia, questo non è di per sé la prova che svolgono un ruolo nella malattia. Pertanto, sono ora in corso studi per identificare CNV specifici associati alla malattia. Ciò ha già portato a segnalazioni di associazioni di malattie con varianti relativamente comuni in popolazioni apparentemente sane. Una parte sostanziale di queste associazioni è stata trovata con geni coinvolti nel sistema immunitario e nella difesa contro le malattie. Il primo esempio di ciò è stata la scoperta che un basso numero di copie di un CNV frequente incluso il gene FCGR3B è associato alla glomerulonefrite nei ratti e negli esseri umani (Aitman et al., 2006). Questo gene svolge un ruolo chiave nella regolazione delle risposte infiammatorie e immunitarie, specialmente nel tethering dei neutrofili agli immunocomplessi e nella clearance di questi complessi, e da allora è stato associato al lupus eritematoso sistemico (LES) e ad altre malattie autoimmuni sistemiche, come la vasculite associata ad ANCA (Fanciulli et al., 2007).
Come descritto in precedenza, le variazioni nel numero di copie di un altro gene, componente del complemento C4, sono state a lungo associate al LES. Questo gene svolge anche un ruolo nella clearance dei complessi immunitari, nonché nell’attivazione dei percorsi del complemento che agiscono contro i microbi invasori e nella riduzione della soglia per l’attivazione dei linfociti B. Recentemente è stato confermato che un basso numero di copie di C4 aumenta il rischio di LES, mentre un numero elevato di copie di questo gene ha un ruolo protettivo contro la malattia (Yang et al., 2007).
Un altro gene coinvolto nella difesa contro la malattia è CCL3L1, che è anche incorporato all’interno di un CNV estremamente comune e altamente polimorfico. Questo gene è stato implicato nella suscettibilità e nella progressione della malattia nell’HIV, poiché CCL3L1 è il ligando più efficace per il recettore della chemochina CC 5 (CCR5), che è il principale co-recettore dell’HIV, quindi è un’importante chemochina soppressiva dell’HIV (Menten et al., 2002). Il possesso di un basso numero di copie CCL3L1 è un importante fattore di rischio per l’HIV, associato a carichi virali più elevati e aumento della successiva perdita di cellule T (Gonzalez et al., 2005).
Forse l’esempio più intrigante di una CNV associata alla malattia che si sovrappone ai geni legati al sistema immunitario è quello dei geni beta defensin, che sono candidati alla variazione della suscettibilità ai disturbi autoimmuni e infiammatori, a causa del loro ruolo antimicrobico e pro-infiammatorio. Questi geni variano notevolmente nel numero di copie sia negli esseri umani (Armour et al., 2007) e anche macachi, suggerendo che questo è un antico hotspot per la variazione del numero di copie (Lee et al., 2008). Una grande unità di ripetizione al cromosoma 8p23.1, tra cui DEFB4, SPAG11, DEFB103, DEFB104 e DEFB105 tra gli altri, è altamente variabile nel numero di copie, con individui che trasportano tra 2 e 12 copie per genoma diploide. Un numero elevato di copie di questa unità aumenta la suscettibilità alla comune psoriasi infiammatoria della malattia della pelle, coerente con una risposta immunitaria esagerata che porta a una malattia infiammatoria (Hollox et al., 2008). Al contrario, un basso numero di copie del gene DEFB4 è stato associato alla malattia di Crohn del colon, che si pensa sia dovuta ad un indebolimento della barriera antibatterica nella mucosa del colon a causa della relativa carenza di beta-defensine (Fellermann et al., 2006). Questo è il primo esempio di un CNV comune che in numeri di copia bassi può portare a una malattia e in numeri di copia alti può portare a un’altra malattia fenotipicamente distinta.
Varianti hanno anche dimostrato di sovrapporre geni rilevanti per il cancro, ad esempio una regione di delezione di 630 kb sul cromosoma 3p21.3 deleted in lung cancer, incorporando tre geni soppressori del tumore TUSC2, TUSC4 e NAT6, è stato trovato per sovrapporre una delezione CNV relativamente comune in una popolazione apparentemente sana (Wong et al., 2007). Molti altri oncogeni e soppressori del tumore sono influenzati dalla variazione del numero di copie, tra cui LPP, MLLT3, MEN1, APC, VAV2, TNFRSF25, BCAS1 e HIC2 (Conrad et al., 2006; de Smith et al., 2007; Wong et al., 2007). Sono in corso studi per determinare le loro conseguenze per la suscettibilità al cancro, ma abbiamo già almeno un esempio di associazione significativa. Una variante di delezione UGT2B17, trovata in circa l ‘ 11-12% dei soggetti sani, presenta un’associazione significativa con il rischio di cancro alla prostata nei caucasici. Aumento dei livelli di testosterone sierico e altri androgeni sono un fattore di rischio per il cancro alla prostata, e si pensa che la cancellazione di questo gene, che è coinvolto nel metabolismo degli androgeni, può portare ad un aumento dei livelli sierici di androgeni (Park et al., 2006). Una domanda interessante, che deve ancora essere studiata, è se esiste una relazione tra i CNV ereditati nelle regioni genomiche rilevanti per il cancro e l’incidenza delle varie perdite e guadagni genomici che si verificano durante la progressione del cancro. Poiché questi cambiamenti hanno un notevole significato prognostico, tale relazione può avere conseguenze importanti per le prime decisioni sulla gestione terapeutica.
Come descritto, i geni coinvolti nello sviluppo del cervello sono arricchiti nei CNV (de Smith et al., 2007), e una percentuale di queste varianti può, quindi, contribuire alla suscettibilità a disturbi neurologici e psichiatrici, come il disturbo bipolare (BD) e la schizofrenia. Infatti, alcuni dei più importanti geni candidati alla BD e alla schizofrenia, come PDE4ß, CHRNA7 e DISC1, sono sovrapposti a varianti note. In una coorte di pazienti con BD, ad esempio, è stato riscontrato un aumento significativo per la presenza di un CNV noto che si sovrappone al GSK3ßgene rispetto ai controlli sani (Lachman et al., 2007). Questo è un gene candidato credibile per BD in quanto è coinvolto nello sviluppo delle cellule neuronali, e topi transgenici con GSK3ßoverexpression hanno dimostrato di imitare atti di mania clinica, con una maggiore attività locomotoria e risposta acustica allo startle (Prickaerts et al., 2006). Il GSK3ßvariant è stato finora documentato solo in due campioni di controllo sani, quindi potrebbe essere descritto come un CNV raro. Alcuni studi finalizzati all’identificazione di varianti associate a particolari malattie, tuttavia, hanno scoperto varianti del numero di copie geniche che sono presenti solo nei pazienti con tali malattie e non nella popolazione generale. Queste varianti dovrebbero, quindi, essere correttamente definite mutazioni del numero di copia (CNMs), in quanto non sono presenti a frequenza apprezzabile (>1%) nella popolazione generale e possono essere la causa diretta della malattia, piuttosto che agire come loci di suscettibilità.
Oltre ai comuni CNV che svolgono un ruolo nei disturbi neurologici, un certo numero di CNM de novo sono stati associati a tali malattie. Varianti che incorporano tre geni espressi dal cervello coinvolti nella segnalazione del glutammato, GLUR7, AKAP5 e CACNG2, sono state trovate solo in pazienti con schizofrenia in uno studio (Wilson et al., 2006). Si ipotizza che questi geni siano espressi in modo differenziato durante lo sviluppo embrionale umano precoce e che lo sviluppo di un normale sistema nervoso centrale dipenda dalla complessa regolazione di questi geni (Wilson et al., 2006). Uno studio recente indica anche che rare varianti de novo con alta penetranza possono essere alla base della schizofrenia in alcuni casi. Xu et al. (2008) ha trovato una frequenza del 10% di nuove varianti in pazienti con schizofrenia sporadica, che era otto volte superiore rispetto ai controlli. Il numero di geni sovrapposti da queste varianti era relativamente piccolo, ma l’analisi GO ha mostrato che le categorie più arricchite erano percorsi associati allo sviluppo neuronale (Xu et al., 2008). Questi risultati sono rispecchiati da un altro recente rapporto di un’associazione con varianti rare che influenzano i geni dello sviluppo neurologico nei casi di schizofrenia (Walsh et al., 2008).
I risultati di questi studi sulla schizofrenia hanno paralleli in recenti indagini sulla genetica dell’autismo, poiché sono state determinate anche associazioni di varianti de novo con questo disturbo dello sviluppo neurologico (Sebat et al., 2007; Marshall et al., 2008). Sebat et al. (2007), ad esempio, ha trovato che la frequenza delle mutazioni spontanee è del 10% nei casi sporadici di autismo, rispetto a solo l ‘ 1% nei controlli non affetti, e un certo numero di geni, tra cui SHANK3, NLGN4 e NRXN1, sono stati implicati nell’eziologia dell’autismo attraverso studi di variazione del numero di copie. L’interpretazione di questi dati è alquanto complicata, tuttavia, dalle difficoltà inerenti a: a) dimostrare che una particolare variazione del numero di copie è effettivamente de novo (la maggior parte delle metodologie attuali soffre di alti risultati falsi negativi e falsi positivi) e b) stabilire il tasso “normale” di generazione di modifiche del numero di copie de novo.
La distinzione tra varianti comuni del numero di copie geniche e CNMs rari non è sempre chiara. Un esempio particolare di questo sono i guadagni e le perdite di numero di copia comuni della regione sul cromosoma 7 che incorpora i geni PRSS1 e PRSS2, mutazioni missense in cui sono noti per causare pancreatite ereditaria. Questa è una malattia autodigestiva, per cui una cascata di attivazione degli enzimi digestivi pancreatici è causata dall’attivazione prematura della tripsina (Le Marechal et al., 2006). I CNV che si sovrappongono ai due geni sono stati trovati in individui sani, ma una triplicazione di questa regione è associata alla malattia. Si pensa che l’aumento del dosaggio dei geni triplicati PRSS1 e PRSS2 possa interrompere l’equilibrio tra l’attivazione e l’inibizione della tripsina all’interno del pancreas (Le Marechal et al., 2006), che suggerisce che una duplicazione dello stesso locus su entrambi i cromosomi potrebbe avere lo stesso effetto. La regione triplicata è, quindi, una mutazione di numero della copia che è alla base della malattia, mentre un singolo guadagno della copia su un cromosoma (cioè CNV di duplicazione) potrebbe essere descritto come CNV della premutazione per il fenotipo sfavorevole. La situazione è ulteriormente complicata, tuttavia, dalla recente identificazione di una duplicazione di questo locus in quattro pazienti con pancreatite ereditaria, che non è stata trovata nei controlli (Masson et al., 2008b): è possibile, quindi, che la duplicazione di questo locus possa, in alcuni individui, causare la malattia ma in altri fungere da CNV benigno.
La stessa malattia ha anche recentemente dimostrato di derivare da un altro meccanismo genetico del tutto. Come accennato in precedenza, Masson et al. (2008a) ha identificato un gene ibrido PRSS2/PRSS1, che descrivono come avente un effetto “doppio guadagno di funzione”, con conseguenze sia qualitative che quantitative, in una famiglia francese con pancreatite ereditaria. Questo gene di fusione consiste essenzialmente in una duplicazione della metà di ciascun gene, agendo così come una CNM “quantitativa”, oltre a una mutazione missense “qualitativa”, che ha portato a un fenotipo altamente penetrante in questa famiglia. Questo sembra essere un nuovo rapporto genotipo-fenotipo.
Finora sono state effettuate pochissime indagini per esaminare i doppi effetti di CNV e SNP. Un esempio, tuttavia, è l’analisi del gene del fattore H del complemento e del cofattore di membrana (CFH), che contiene una variante dell’amminoacido che predispone alla degenerazione maculare legata all’età (Klein et al., 2005). Questo gene è contenuto all’interno di una regione CNV; quindi è possibile che variazioni nel numero di copie di questo gene, o la sua regione genomica circostante, potrebbero modificare il rischio di malattia. A sostegno di ciò, un aplotipo che trasporta eliminazioni dei geni CFHR1 e CFHR3 vicini ha dimostrato di essere protettivo contro la malattia (Hughes et al., 2006). Questo esempio evidenzia la necessità di valutare il contributo di entrambi i tipi di variante a fenotipi complessi e malattie, in quanto casi come questi possono essere solo la punta dell’iceberg (Masson et al., 2008a).
È probabile, quindi, che le variazioni nel numero di copie del gene giochino un ruolo importante nella salute umana, con alcuni CNV comuni del gene che aumentano la suscettibilità ad alcune malattie complesse, mentre i cosiddetti CNM sono la causa diretta delle malattie mendeliane. Le stime attuali indicano che le varianti del numero di copie si sovrappongono più del genoma umano rispetto a SNPs (stime attuali di bp 29% bp cf. 0,4% (http://projects.tcag.ca/variation)); tuttavia, resta da dimostrare se i CNV siano la principale fonte di differenze interindividuali nel fenotipo fisiologico, così come nella forma fisica generale e nella suscettibilità alle malattie. L’interazione tra SNP e CNV funzionalmente rilevanti aggiunge un ulteriore livello di complessità alle indagini.