1 Introduzione
Geni per proteine transmembrana (TMPs), rappresentano il 20-30% della maggior parte dei genomi (Wallin & Heijne, 1998), e in base alla loro ruoli importanti nella fisiologia cellulare, TMPs sono gli obiettivi di una grande frazione di clinicamente utili farmaci. Pertanto, la determinazione delle loro strutture e modalità di azione è di notevole importanza. Tuttavia, il numero di strutture TMP ad alta risoluzione disponibili rimane relativamente basso (vedi Pagina Web di Stephen White; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Due le spiegazioni che sono spesso invocati per la difficoltà di ottenere ben diffracting cristalli di TMPs per l’uso in diffrazione dei raggi X di studi (1) TMPs sono strutturalmente dinamica e flessibile regioni che rendono difficile per la proteina di adottare la divisa conformazione necessario per il confezionamento in un cristallo; e (2) le superfici delle regioni transmembrana di TMPs non partecipare così facilmente come le superfici dei globulari proteine solubili in interazioni proteina–proteina che sono necessari per imballaggio di cristallo. L’introduzione di una proteina solubile stabile in una regione esposta in superficie di un TMP fornisce un modo per aggirare potenzialmente entrambi questi problemi, poiché tale inserimento in una posizione interna in un TMP può ridurre la flessibilità complessiva e poiché la presenza di un dominio solubile facilmente cristallizzabile può fornire contatti intermolecolari necessari per la cristallizzazione (Chun et al. Nel 2012, Engel, Chen, & Privé, 2002).
La fusione del lisozima T4 (T4L) in posizioni interne in TMPS ha, fino ad oggi, fornito un approccio di successo per la determinazione delle strutture di diversi membri dell’importante superfamiglia GPCR (Cherezov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Fenalti et al., 2014; Granier et al., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola et al., 2008; Kruse et al., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; White et al., 2012; Wu et al., 2010, 2012; Xu et al., 2011; Zhang et al., 2012). Fusioni interne simili di un apocytochrome b termicamente stabilizzato (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014) e rubredoxin (Tan et al., 2013) hanno anche prodotto strutture GPCR. Inoltre, diverse strutture GPCR sono state ottenute per cristallizzazione di costrutti in cui il partner proteico stabilizzante è stato fuso all’estremità N della sequenza del recettore, piuttosto che in una posizione interna (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thompson et al., 2012; Wu et al., 2014), suggerendo che il ruolo delle proteine di fusione nella facilitazione della formazione di contatti intermolecolari può essere più importante per promuovere la cristallizzazione rispetto alla riduzione della flessibilità del TMP. Approcci alternativi per ottenere strutture GPCR che non comportano l’uso di proteine di fusione hanno incluso la cocristallizzazione con anticorpi anti-recettori (Kruse et al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Anello et al., 2013) e la cristallizzazione di varianti GPCR che sono state termostabilizzate dall’introduzione di mutazioni puntiformi e delezioni (Egloff et al. Nel 2014, Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). Infatti, la maggior parte delle varianti GPCR contenenti proteine di fusione utilizzate per la determinazione della struttura di successo hanno anche incorporato mutazioni puntiformi e troncamenti progettati per migliorare ulteriormente la stabilità proteica e ridurre la flessibilità.
L’inserimento di proteine solubili stabili in TMPS allo scopo di promuovere la cristallizzazione è stato generalmente eseguito come inserimento o sostituzione di residui nel terzo ciclo intracellulare (IC3) di GPCR. Ciò si basa sull’aspettativa che questa regione nei recettori sia flessibile e possa controllare il movimento relativo delle eliche circostanti (Rosenbaum et al., 2007), oltre a ridurre la probabilità che l’inserimento del partner di fusione interrompa la struttura generale del GPCR (Chun et al., 2012). Mentre tali inserimenti spesso non interrompono le strutture complessive dei recettori (basate sulla ritenzione di almeno una certa affinità di legame del ligando da parte dei costrutti di fusione), generalmente provocano la perdita della capacità di attivare la proteina G trimerica affine (Rosenbaum et al., 2007), che non è sorprendente dal momento che il ciclo IC3 è spesso il sito di interazioni funzionali tra GPCR e le proteine trimeriche G che sono i loro effettori immediati a valle. Inoltre, i criteri per stabilire particolari siti di giunzione per l’inserimento di proteine di fusione e per determinare la quantità di sequenza di recettori che sostituiscono non sono ben stabiliti. Una fusione riuscita deve fornire una corrispondenza ottimale tra la spaziatura e l’orientamento dei termini N e C della proteina inserita e i siti di giunzione nel GPCR (Chun et al., 2012; Engel et al., 2002). Pertanto, la creazione di una fusione utile può richiedere la sintesi o la costruzione di più versioni di geni fusi (Rosenbaum et al., 2007).
Descriviamo qui una strategia per la generazione e lo screening di una libreria di forme varianti di un recettore contenente inserimenti di T4L in diversi punti del terzo ciclo intracellulare (IC3) in sostituzione di diversi numeri di residui di amminoacidi nella sequenza del ciclo (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Esprimendo i recettori nel lievito, è possibile creare librerie randomizzate di varianti con inserimenti di lisozima e schermare direttamente i costrutti con i massimi livelli di espressione complessiva, il numero di siti di legame del ligando sulla superficie cellulare e persino la funzione del recettore, dosata in base all’attivazione della proteina G affine. Gli approcci hanno avuto successo nell’identificare i recettori con inserimenti nel ciclo IC3 che mantengono la funzione di segnalazione quasi completa. Ciò suggerisce che, se collegata tramite sequenze di collegamento appropriate, la molecola T4L può essere inserita in questo ciclo senza impedire l’accesso della proteina G alle superfici pertinenti del recettore attivato.
I protocolli descritti sono stati sviluppati utilizzando Ste2p, un GPCR endogeno del lievito Saccharomyces cerevisiae utilizzato come sistema iniziale trattabile per il quale non è ancora disponibile alcuna struttura tridimensionale. Tuttavia, approcci simili potrebbero essere utilizzati per identificare varianti contenenti inserzione dei numerosi GPCR di mammiferi che sono stati segnalati per essere in grado di attivare la via di risposta del feromone del lievito (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), o ad altri TMP per i quali è possibile analizzare la funzione in cellule intatte. Inoltre, le specie di lievito sono state utilizzate come sistemi di espressione per la determinazione della struttura di GPCR e altri TMP (Clark et al., 2010), anche per la determinazione della struttura cristallina del recettore umano dell’istamina H1 (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p è il recettore per il lievito accoppiamento feromone α-factor, un peptide 13-residuo. Il legame di questo ligando provoca l’attivazione di una proteina G eterotrimerica citoplasmatica, che, a sua volta, attiva una via della chinasi della MAPPA, in ultima analisi, portando a risposte trascrizionali, cambiamenti nella forma cellulare, arresto del ciclo cellulare e fusione con cellule di lievito del tipo di accoppiamento opposto.